Векторы на основе вирусов животных. Векторы на основе вирусов животных (ретровирусов, полиомавирусов) и их использование в генотерапии

Лентивирусы относятся к ретровирусам и характеризуются более длительным инкубационным периодом. Терапевтическим преимуществом векторов на основе лентивирусов, по сравнению с ретровирусными векторами, является их способность переносить длинные фрагменты генетической информации в геном инфицируемой клетки. Эти вектора основаны преимущественно на вирусах иммунодефицита человека (ВИЧ) и быка, и обладают всеми уникальными характеристиками вирусного вектора MoMLV, а также способностью переносить гены в постмитотические клетки in vitro и in vivo (18). Несмотря на подтверждение эффективного переноса генов в раковые клетки на моделях солидных опухолей с помощью векторов на основе ВИЧ, терапевтическое использование этих векторов вызывает опасения, поскольку ВИЧ является серьезным патогеном человека. Однако в настоящее время проводятся клинические испытания лентивирусных векторов, направленные на оценку безопасности их применения в терапии СПИДа (19). Более безопасными считаются вектора на основе лентивирусов быка. Одним из примеров таких векторов служит безопасный для человека вирус болезни Йембрана JDV (Jembrana Disease Virus), поражающий определенные виды крупного рогатого скота в округе Йембрана на острове Бали в Индонезии (20, 21). Вирус JDV обладает теми же преимуществами в качестве вектора, что и ВИЧ: он способен интенсивно размножаться и интегрироваться в хромосомы не пролиферирующих клеток.

(Б) Аденовирусные векторы

Одной из наиболее хорошо изученных и широко используемых систем доставки терапевтических генов в раковые клетки человека являются вектора на основе аденовирусов (АВ, adenoviral vector - AV). Они особенно полезны в тех случаях, когда необходима лишь временная продукция терапевтического гена. Аденовирусы способны к воспроизводству в больших количествах и характеризуются эффективным переносом генов в различные типы раковых клеток (22). Два варианта векторов на основе аденовирусов были одобрены в Китае для клинического применения (23).

Кроме этого, несколько векторов на основе собачьих, свиных, овечьих, бычьих и птичьих аденовирусов было разработано для генотерапии раков человека. Один из таких векторов продемонстрировал терапевтическую эффективность на модели рака простаты у животных (24).

Основной проблемой, возникающей при разработке аденовирусных векторов для терапии рака, является недостаточная инфицирующая способность вирусов. В настоящее время проводятся интенсивные исследования, направленные на повышение прицельности и терапевтической эффективности рекомбинантных аденовирусных векторов (25).

(В) Векторы на основе адено-ассоциированных вирусов

Вектора на основе адено-ассоциированных вирусов (ААВ, аdeno-associated virus - AAV) не вызывают токсического эффекта и проявляют высокую инфицирующую способность, как показывают доклинические испытания нескольких таких вирусов (26). На моделях глиомы у грызунов было продемонстрировано, что ААВ, кодирующий рецептор фактора роста сосудого эндотелия VEGF (vascular endothelial growth factor), способен блокировать рост опухолей. Несмотря на высокую эффективность ААВ, технология их получения и очитки представляет собой достаточно сложный и дорогостоящий процесс (27).

(Г) Векторы на основе вирусов герпеса

Благодаря высокой эффективности и не сложной методике получения, векторы на основе вирусов герпеса пользуются особенной популярностью среди разработчиков векторных систем. В настоящее время со многими вариантами терапевтических векторов на основе вирусов герпеса проводятся клинические испытания. Как в случае векторов на основе других вирусов, терапевтический интерес представляют только репликационно-компетентные штаммы вирусов герпеса. Первый вектор такого рода был создан на основе мутантного вируса герпеса с дефектным геном r34.5 , отвечающим за нейротоксичность вируса. Инактивация гена r34.5 ограничила способность вируса к размножению в клетках центральной нервной системы и блокировала возможность его существования в латентной форме. Однако позже обнаружилось, что отсутствие активности гена r34.5 значительно снизило способность мутантного вируса к воспроизводству в раковых клетках (28).

Терапевтические возможности векторов на основе вирусов герпеса могут существенно ограничиваться наличием к нему иммунитета у пациентов. Иммунный ответ организма предотвращает перенос вирусами терапевтических генов к периферическим органам и вызывает гепатотоксичность. Однако некоторые мутантные штаммы вирусов герпеса продемонстрировали успешное лечение рака печени в модели на мышах, обусловленное, как предполагают ученые, непосредственным вирусным онколизисом и активностью специфических эффекторных клеток иммунной системы (29).

(Д) Вирусные векторы направленного действия

Основной проблемой, связанной с генотерапией вирусными векторами, остается низкая эффективность адресной доставки генов в раковые клетки. На пути к клетке-мишени вирус сталкивается с физическим препятствием – эндотелиальной стенкой сосудов. В качестве одного из способов решения этой проблемы был разработан аденовирусный вектор, нацеленный на рецепторный механизм трансцитоза (прохождения сквозь клетки эндотелиалия) с помощью специальных адаптерных молекул (32). Подвергшиеся трансцитозу вирусные частицы сохраняли способность заражать клетки, но эффективность транспорта вирусов сквозь клетки оставалась низкой. В настоящее время разрабатываются аденовирусные вектора, содержащие как сигнальные молекулы, направляющие вирусы на трансцитоз, так и молекулы, опосредующие связывание и заражение раковых клеток, находящихся «по ту сторону» стенки сосудов (33).

(Е) Мультифункциональные частицы на основе вирусных векторов

Концепция мультифункциональных частиц (МФЧ) на основе вирусных векторов возникла относительно недавно. Она направлена на то, чтобы терапевтические вирусные векторы осуществляли сразу несколько функций: адресную доставку генетического материала именно в раковые клетки, давали возможность их визуализации в организме и обладали бы прогрессирующим онколитическим действием. В качестве примера МФЧ на основе вирусного вектора можно привести ААВ с модифицированными белковыми «шипами», находящимися на оболочке вируса (с помощью шипов вирус взаимодействует с клеткой-мишенью). Изменения позволили одновременно «нацеливать» вирусы на раковые клетки и визуализировать передвижение, воспроизведение и распространение ААВ. Взаимодействие тимидин-киназы ТК ВПГ, находящейся на поверхности модифицированного ААВ, с известным субстратом для позитронной эмиссионной томографии (Positron Emission Tomography, PET) 18F-пенцикловиром (18F-penciclovir) позволяет проводить мониторинг вирусных частиц в клинической практике. Кроме этого, фермент ТК ВПГ открывает возможности для так называемой суицидной генотерапии, суть которой заключается в следующем: фермент ТК преобразует свои субстраты (такие лекарства, как ганцикловир) в метаболиты, узнаваемые ферментами зараженной клетки. Последовательное воздействие клеточных белков на эти метаболиты приводит к образованию токсичного конечного продукта, вызывающего гибель клетки (34). Интересно, что продукция ТК ВПГ инфицированной опухолевой клеткой индуцирует самоуничтожение смежных клеток, в чем проявляется одно из свойств МФЧ – прогрессирующее онколитическое действие.

Концепция МФЧ на основе вирусных векторов открывает широкие возможности применения нанотехнологий. Мониторинг вирусных частиц можно осуществлять с помощью наноразмерных меток, иммобилизованных на оболочках вирусов (35). Однако вопрос об адресной доставке вирусных МФЧ в клетки опухоли остается открытым.

Механизмы генотерапии с помощью вирусных векторов

(А) Коррекционное добавление гена

Все онкологические заболевания принято подразделять на p53-зависимые и p53-независимые, поскольку большинство случаев заболевания раком опосредовано мутациями в гене p53 . Белок р53 представляет собой известный опухолевый супрессор, основная функция которого заключается в поддержании стабильности генома. Он принимает участие в регуляции клеточного цикла, в исправлении возникающих дефектов ДНК и в апаптозе – запрограммированной клеточной гибели. Воздействие на клетку факторов, вызывающих изменения в структуре ДНК, таких как ультрафиолетовое излучение, ионизирующая радиация и различные химические вещества, приводит к активации белка p53, который индуцирует либо арест клеточного цикла, необходимый для исправления возникших дефектов ДНК (репарацию), либо запускает механизм апоптоза. По этой причине мутации в гене p53 могут приводить к неконтролируемой клеточной пролиферации и к мутагенезу, опосредуя возникновение и прогрессию злокачественного новообразования.

Доклинические испытания показали, что замена мутантного гена p53 в раковых клетках геном дикого типа (не содержащим мутаций) с помощью методов генотерапии, приводит к полному восстановлению функций белка p53 и запускает апоптоз злокачественных клеток(36,37).

Клинические испытания ретровирусных и аденовирусных векторов, несущих неповрежденные гены p53 , оказались эффективными в замене дефектных генов p53 у пациентов, страдающих немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ, non small cell lung cancer - NSCLC) и бронхоальвеолярной карциномой (38,39,40). К сожалению, в клинических испытаниях не удалось обнаружить значительного терапевтического эффекта даже при совместном применении аденовирусных векторов, рекомбинантных по гену p53 дикого типа, и химиотерапии (41).

(Б) Суицидная генотерапия

Суть суицидной генотерапии заключается в доставке в злокачественные клетки гена, кодирующего фермент, который конвертирует пролекарство в лекарство - «суицидный токсин», вызывающий гибель зараженных раковых клеток. Ярким примером суицидного фермента является тимидинкиназа (ТК) вируса простого герпеса (ВПГ) (herpes simplex virus - HSV). ТК ВПГ преобразует нетоксичные аналоги нуклеозидов, такие как ганцикловир или ацикловир, в токсичные вещества, приводящие к гибели клеток. Наподобие описанной выше методики аденовирусного переноса гена p53, доклинические испытания аденовирусного вектора AdHSV TK (adenoviral HSV TK), кодирующего ТК ВПГ, продемонстрировали гибель не только инфицированных, но и смежных с ними клеток при систематическом введении ганцикловира. Эффект объясняется как воздействием токсинов, высвобождаемых зараженными клетками, на соседние клетки, так и ответом иммунной системы на инфекцию (42).

Векторы на основе вирусов животных (ретровирусов, полиомавирусов) и их использование в генотерапии.

Ретровирусные векторы

Опыт клинических испытаний с участием более 200 пациентов показывает, что дефектные по репликации ретровирусные векторы не оказывают каких-либо неблагоприятных побочных эффектов. Тем не менее безопасности их применения продолжают придавать большое значение. Создана конструкция, называемая плазмовирусом, которая содержит ретровирусные гены gag и poh находящиеся под контролем 5"-LTR-npoMOTopa, a также «терапевтический» ген и ген env, управляемые цитомегаловирусным промотором. После трансфекции плазмовирус запускает образование дефектных по репликации вирусных частиц, причем вероятность рекомбинации с образованием компетентных по репликации ретровирусов очень мала. Вектор может переносить не более 3,5 т. п. н. ДНК, но и длина большинства потенциальных «терапевтических» кДНК и генов - супрессоров опухолей составляет 0,5-2 т. п. н.

В ретровирусную векторную систему внесены дополнительные усовершенствования: увеличено число образующихся вирусных частиц, повышена эффективность трансдукции, осуществлена генноинженерная модификация, обеспечивающая их проникновение в неделяшиеся клетки, повышена специфичность инфекции. В последнем случае геном рекомбинантного ретровирусного вектора упаковывается в оболочку другого вируса, белок которой и определяет специфичность связывания ретровируса и спектр инфицируемых им клеток. Это явление называется фенотипическим смешиванием (pseudotype formation). Фенотипически смешанный вирус получают с помощью котрансфекции клеточной линии, которая синтезирует продукты генов gag и pol, рекомбинантным ретровирусным вектором и вектором, экспрессирующим ген env другого вируса. Изменяя ген env, можно как сузить спектр инфицируемых вирусом клеток до строго определенного типа, так и расширить его. Кроме того, в ген env ретровируса можно встроить нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, который связывается с определенным клеточным рецептором и обеспечивает внедрение рекомбинантного ретровируса в нужные клетки. И наконец, можно добиться специфичности экспрессии терапевтического гена, осуществляя ее под контролем промотора, специфичного для определенных клеток.

Аденовирусные векторы

Аденовирусы инфицируют неделящиеся клетки человека и широко используются в качестве живых вакцин, которые предотвращают респираторные инфекции и гастроэнтериты, не оказывая побочного действия. Эти свойства делают аденовирусы перспективными для доставки генов в клетки-мишени.

Для получения аденовирусного вектора провели котрансфекцию клеточной линии, синтезирующей продукты аденовирусного гена Е1, двумя участками генома аденовируса (рис. 21.7). Один из них может существовать в виде гатазмиды в Е. coli и содержит вместо Е1 -области «терапевтический» ген, фланкируемый нуклеотидными последовательностями аденовируса, а второй представляет собой молекулу ДНК аденовируса, которая лишена 5"-концевого участка, включающего El-область, и имеет перекрывающийся участок с несущей терапевтический ген плазмидой. Рекомбинация между двумя трансфицирующими фрагментами ДНК в области их перекрывания приводит к восстановлению полноразмерного аденовирусного гена, в котором вместо Е1-области находится терапевтический ген. Продукты гена Е1, поставляемые клеткой-хозяином, инициируют образование вирусных частиц, высвобождающихся из клетки в результате лизиса. В отсутствие рекомбинации трансфицирующие молекулы ДНК, обладающие недостаточной длиной, не могут упаковываться в вирусные частицы. Вероятность того, что между областью Е1 в геноме клетки-хозяина и ДНК рекомбинантного аденовируса произойдет рекомбинация с образованием компетентных по репликации вирусов, чрезвычайно мала.

После того как рекомбинантный аденовирус инфицирует клетку-мишень, его ДНК проникает в ядро, где и происходит экспрессия «терапевтического» гена. Рекомбинантная ДНК не интегрирует в хромосому и сохраняется непродолжительное время, поэтому при проведении генотерапии с использованием аденовирусных векторов необходимо вводить их с определенной периодичностью.

Аденовирусные векторы использовали в клинических испытаниях по генной терапии муковис-цидоза.

Т к у эукариот (животных) не обнаружено ядерных плазмид, то единственными «донорами» для переноса векторов могут быть вирусы. Вирусы животных плохи для использования потому что:

1. В их геноме нету несущественных областей, которые можно было бы заменить клонированной ДНК. => векторы сконструированные на базе таких вирусов дефектны.

2. Емкость вирусных векторов ограничена, т к в капсид может упаковываться лишь определённое кол-во ДНК(а гены эукариот очень большие 30 и > пар нуклеотидов).

Вирус SV-40.

Развиваются в клетках обезьяны. Т к он обладает онкотрансформирующим действием и может нарушить структуру генов, его редко используют для интеграции клонированных генов в клеточные хромосомы. С помощью таких векторов можно наблюдать экспрессию.

Вирус осповакцины.

Обладает двунитевой ДНК, которая имеет уникальное строение. Это линейная молекула на обоих концах которой имеются шпильки, замыкающие ковалентно обе нити ДНК. Привлекателен в качестве вектора, т к:

1. широкий спектр клеток-хозяев. От беспозвоночных до позвоночных.

2. Позволяет внедрять большие фрагменты чужеродной ДНК (до 25 т п н.), у самого вируса геном 187 т. п. н..

3. Безопасен для использования.

Их используют для создания рекомбинантых вирусов, в геном которых встроены гены кодирующие белки-антигены различных болезнетворных вирусов (микробов), создавая при этом иммунитет к инфекционным заболеваниям.

Ретровирусы.

Обладают однонитевой РНК. Их жизненный цикл обязательно проходит через образование двуцепочечной ДНК. Преимущества:

1. Исключительно широкий круг хозяев.

2. Структура интегрированной ДНК исключает возможность перестройки клонированного в ней гена.

3. Клетки не погибают, а продуцируют вирусы в течение многих генераций.

Так же используют:

Аденовирусы;

Бакуловирусы (инфицируют насекомых).

При трансформации растений используют и векторы, сконструированные на основе растительных вирусов. Однако их набор ограничен. Это объясняется тем, что у большинства растительных вирусов генетическим материалом является РНК, и только у некоторых из них, таких, как вирус мозаики цветной капусты (CaMV) и группы вирусов Gemini, наследственным материалом служит ДНК. Недостаток вирусных векторов - ограниченная протяженность встраиваемых генов (от 200 до 500 п.н.) и высокая специфичность по отношению к видам растений. Так, вирус мозаики цветной капусты можно использовать только при трансформации растений, относящихся к семейству крестоцветных.

Безвекторные системы

Генная пушка (рис. 13.1). Этот метод носит название биологической баллистики. Он заключается в обстреле из вакуумной пушки (генная пушка) суспензий клеток растений, протопластов и каллусов. Обстрел растительных целей (тканей) производят частицами золота или вольфрама (диаметр 0,6-1,2 мкм), на которые напылена чужеродная ДНК. Растительные клетки располагают на специальной целлофановой пластине. Частицы металла пронизывают клетки, оставляя в них ДНК. Трансформируется при этом около 10-15 % клеток, часть из которых регенерирует в нормальные растения. Хотя процесс трансформации носит случайный характер, к настоящему времени этим способом получены трансгенные растения, преимущественно однодольных культур (кукурузы, риса, пшеницы и др.).

Рис. 13.1.

(Цильке, 2001. - С. 21)

Метод электропорации. Это один из методов прямого введения ДНК в клетку. Растительные клетки погружают в среду с находящейся в ней чужеродной ДНК. Через эту среду пропускают (доли секунды!) электрический ток напряжением 250-300 В. Через расширившиеся поры ядерной мембраны чужеродная ДНК проникает в ядра и включается в хромосомы.

Метод микроинъскции. С помощью микроигл (наружный диаметр 2 мкм) чужеродную ДНК вводят в ядра клеток, закрепленных на стекле при помощи полилизина.

Использование «агентов слияния». В качестве «агентов слияния» используют положительно заряженные сферы липидов (липосомы ), которые обволакивают векторную ДНК, защищая ее от действия нуклеаз. Находящаяся в липосомах ДНК проникает с их помощью в растительные клетки (механизм изучен недостаточно) и включается в геном.

Оглавление темы "Биотехнология. Генная инженерия. Генная терапия.":
1. Биотехнология. Наука биотехнология. Этапы развития биотехнологии.
2. Области применения биотехнологии. Области использования биотехнологии. Оптимизация микробиологических процессов в биотехнологии.
3. Промышленное применение микроорганизмов. Производство продуктов микробного синтеза. Производство антибиотиков. Производство вакцин.
4. Генная инженерия. Биобезопасность. Актуальность генной инженерии. Теоретическая база генной инженерии.
5. Организация генетического материала в клетке. Генотип. Что такое генная инженерия? Этапы получения генной продукции.
6. Применение методов генной инженерии. Показания (оправданность) применения генной инженерии. Причины применения генной инженерии.
7. Биобезопасность в генной инженерии. Документы регламентирующие биобезопасность.
8. Группы опасности микроорганизмов. Оценка риска применения генетически модифицированных микроорганизмов.
9. Генная диагностика. Генная терапия. Что такое генная диагностика и генная терапия? Виды генной терапии.
10. Векторы. Векторы на основе РНК-содержащих вирусов. Векторы на основе ДНК-геномных вирусов. Невирусные векторы.
11. Перспективы генной терапии. Будущее генной терапии. Задачи генной терапии. Векторы. Векторы на основе РНК-содержащих вирусов. Векторы на основе ДНК-геномных вирусов. Невирусные векторы.

Как было указано выше, для переноса соответствующих генов в клетку используют различные векторы [от лат. vector, переносчик]. Основная проблема при их разработке - преодоление иммунологического барьера реципиента, ограждающего организм от различных внешних воздействий, в том числе и от внедрения чужеродной ДНК в геном клеток. В этом плане особый интерес представляют вирусы, так как из всех известных агентов лишь они способны более или менее успешно интегрировать генетический материал в геном клеток человека. Поэтому все усилия специалистов генной терапии на настоящий момент сконцентрированы в области генной инженерии вирусов, применяемых в качестве векторов, доставляющих терапевтические гены в клетки организма больного.

Векторы на основе РНК-содержащих вирусов

РНК-геномные вирусы легко интегрируют в геном клетки-хозяина, тем самым обеспечивая долговременную экспрессию необходимого гена. Для создания генно-терапевтических векторов наиболее перспективны ретровирусы. С их участием проведено около 60% всех клинических попыток генной терапии.

Ретровирусы относительно безвредны для человека, исключая, конечно, ВИЧ и Т-лимфотропные вирусы человека. Наиболее часто в качестве вектора применяют вирус лейкемии мышей. При разработке векторов из их состава полностью исключают гены, кодирующие синтез продуктов, обеспечивающих репродукцию. Кодирующая ёмкость трансгенов в составе ретрови-русных векторов не превышает 8000 пар оснований нуклеиновых кислот.

Основные проблемы применения РНК-вирусных векторов - эффективная доставка генетического материала в клетки, поддержка долговременной экспрессии и трансдукция неделящих-ся клеток (большинство РНК-векторов неспособно к эффективному переносу трансгенов в покоящиеся клетки). Однако неспособность ретровирусов к трансдукции покоящихся клеток в конкретной ситуации может оказаться и выгодной, например, в генной терапии глиобластом (злокачественные опухоли мозга). Идея их применения заключается в избирательной трансдукции делящихся клеток в очаге поражения - опухолевых клеток и клеток сосудов; нервные клетки не делятся и потому не служат мишенью ретровирусных векторов.

Векторы на основе ДНК-геномных вирусов

Векторы , созданные на основе ДНК-вирусов обладают большими размерами по сравнению с РНК-геномными вирусами и поэтому могут вмещать фрагменты ДНК (трансгены) длиной до 35 000 пар оснований.

Аденовирусные векторы . На основе аденовирусов создают векторы для генной терапии in situ муковисцидоза и злокачественных опухолей. Аденовирусные векторы способны к высокоэффективной трансдукции большого спектра клеточных типов человека, включая неделящиеся клетки. Особое внимание заслуживают векторы на основе аденоасеоциированного вируса. Аденоассоциированный вирус - непатогенный вирус, широко распространённый у человека (AT к его Аг обнаруживают у 80% людей). Вирус тропен к определённой части генома- он интегрируется преимущественно с коротким плечом хромосомы 19. В экспериментах показана эффективность векторов, созданных на основе аденоассоциированного вируса, в трансдукции клеток мозга, скелетных мышц и печени.

Другие ДНК-геномные вирусы . Среди остальных ДНК-содержащих вирусов относительно часто применяют вирус простого герпеса (ВПГ), проявляющий тропность к нервной ткани (соответственно используют для трансдукции клеток мозга).

Невирусные векторы

Невирусные векторы (молекулы ДНК со свойствами транспозонов или вставочных последовательностей) менее распространены, чем векторы на основе вирусов. Тем не менее не вирусные векторы обладают многими преимуществами, такими как безопасность и простота конструирования. Путём конструирования синтетической системы по доставке генов внутрь клетки можно избежать опасности продуцирования рекомбинантного вируса или других токсических эффектов.

100 р бонус за первый заказ

Выберите тип работы Дипломная работа Курсовая работа Реферат Магистерская диссертация Отчёт по практике Статья Доклад Рецензия Контрольная работа Монография Решение задач Бизнес-план Ответы на вопросы Творческая работа Эссе Чертёж Сочинения Перевод Презентации Набор текста Другое Повышение уникальности текста Кандидатская диссертация Лабораторная работа Помощь on-line

Узнать цену

Ретровирусные векторы

Опыт клинических испытаний с участием более 200 пациентов показывает, что дефектные по репликации ретровирусные векторы не оказывают каких-либо неблагоприятных побочных эффектов. Тем не менее безопасности их применения продолжают придавать большое значение. Создана конструкция, называемая плазмовирусом, которая содержит ретровирусные гены gag и poh находящиеся под контролем 5"-LTR-npoMOTopa, a также «терапевтический» ген и ген env, управляемые цитомегаловирусным промотором. После трансфекции плазмовирус запускает образование дефектных по репликации вирусных частиц, причем вероятность рекомбинации с образованием компетентных по репликации ретровирусов очень мала. Вектор может переносить не более 3,5 т. п. н. ДНК, но и длина большинства потенциальных «терапевтических» кДНК и генов — супрессоров опухолей составляет 0,5—2 т. п. н.

Аденовирусные векторы

Аденовирусные векторы использовали в клинических испытаниях по генной терапии муковис-цидоза.