Bacillus cereus ip 5832 культурально морфологические свойства. Bacillus cereus

Bacillus cereus
Bacillus cereus - это повсеместно встречающиеся грамположительные, спорообразующие, подвижные палочки. Они вызывают у людей желудочные заболевания (диарею и др.), а также септицемию, эндокардит, поражения центральной нервной системы. Заболевание, как правило, непродолжительное и прекращается без какого-либо лечения, однако зарегистрированы также и единичные смертельные случаи. Отчетность о пищевых отравлениях Bacillus cereus не регистрируется, поскольку отмечено относительно низкое число случаев, вызванных ими заболеваний (до 1% от общего числа). Частота заболеваний географически варьирует. Так, в отдельных странах они составляют менее 1% всех пищевых отравлений, в то время как в других - более 30%. Bacillus сereus выделяется из продуктов сравнительно часто, что делает этот вид бактерий значимым индикаторным тест-организмом для пищевой промышленности. Пищевые продукты, подверженные наиболее частому риску заражения - это мясные и молочные продукты, овощи, супы, специи и, в особенности, продукты детского питания. Почти все штаммы Bacillus сereus продуцируют токсины. Цитотоксические энтеротоксины продуцируют почти 95% изолятов Bacillus сereus. Из них негемолитический энтеротоксин (NHE) продуцируют более чем 90% штаммов, а гемолизин BL (HBL) около 55% исследованных штаммов. Полагают, что HBL и NHE образуются в кишечнике больного после употребления продуктов, загрязненных вегетативными клетками или спорами Bacillus сereus. В дополнение к этим двум токсинам некоторые штаммы Bacillus сereus продуцируют термостабильный рвотный энтеротоксин (ЕТЕ). Предполагается, что вначале энтеротоксин ЕТЕ накапливается в пище, причем чаще в продуктах, содержащих крахмал, таких как рис и макаронные изделия. По указанным причинам контроль названных продуктов на содержание энтеротоксинов с применением надежных ускоренных методов тестирования становится все более актуальным.

Патогенность, масштабы заболевания
Bacillus cereus является условно патогенным микроорганизмом, котрый вызывает у человека спорадические пищевые отравления. Bacillus cereus повсеместно распространен в природе. Этиологическая роль Bacillus cereus при пищевых отравлениях первоначально изучена и описана Наugе в 1950 г. Источником пищевых отравлений, обусловленных Bacillus cereus, сперва считали кулинарные изделия, содержащие картофельный крахмал. Затем были описаны вспышки аналогичных отравлений, обусловленные растительными, мясными, рыбными и другими пищевыми продуктами. Наиболее быстро Bacillus cereus размножается в измельченных продуктах (фарш, котлеты, колбаса, кремы). В сырье допускается не более 100 клеток/г, в консервах присутствие Bacillus cereus не допускается. В стерилизованных мясных консервах при соблюдении установленных технологических режимов, клетки этой бактерии отсутствуют. Когда в консервированном продукте остаются жизнеспособные споры, то в условиях хранения консервов при 20 о С может отмечаться размножение возбудителя. На поверхности продукта при этом появляется налет серого цвета, изменяются его запах и консистенция.

Bacillus cereus способен вызывать диарейный синдром также у животных, птиц и насекомых по истечении 6-18 ч после поедания ими зараженного корма. Первично это обусловлено несколькими видами токсинов (NHE, НBL, bc-D-ENT), содержащимися в инфицированной пище, а впоследствии - размножением бактерии в кишечнике. Этот комплекс токсинов Bacillus cereus вызывает цитотоксический эффект и секрецию жидкости в кишечнике. При постановке биопробы на мышах у животных в месте введения наблюдается некроз кожи, а в последующем гибель.

Морфология бактерий и колоний
Палочковидные (0,9-1,5 х 3-5 мкм), спорогенные хемоорганотрофные аэробные или факультативно-анаэробные бактерии из семейства Bacillaceae (под микроскопом клетки-палочки с обрубленными концами внешне напоминают восковые свечи). Эндоспоры расположены центрально, не превышают размер клетки, жгутики - перетрихиально. Бактерии морфологически сходны с Bасillus anthracis, но обладает подвижностью. На селективном агаре образуют колонии диаметром 1,5-2 мм, окруженные зонами преципитата диаметром 4-5 мм. В первые часы роста колонии округлые, выпуклые, затем края колоний становятся изрезанными. Выросшие на агаре колонии имеют восковидный вид. На жидких средах Bacillus cereus образует хлопьевидный осадок, нежную пленку на поверхности и вызывает помутнение бульона.

Физиолого-биохимические особенности
Bacillus сereus - аэроб, но может расти и при недостатке кислорода. На МПА образует крупные, распластанные, серовато-беловатые колонии с изрезанными краями, некоторые штаммы продуцируют розовато-коричневый пигмент, на кровяном агаре вырастают колонии с широкими, резко очерченными зонами гемолиза; на МПБ образует нежную пленку, пристеночное кольцо, равномерное помутнение и хлопьевидный осадок на дне пробирки. Все штаммы Bacillus cereus интенсивно растут при рН = 9-9,5, при рН 4,5-5 рост клеток прекращается. Оптимальная температура роста - 30-32 о С, максимальная - 37-48 о С, минимальная 10 о С. Бациллы чувствительны к действию гамма-фага, гемолизируют эритроциты барана, обладают высокой протеолитической активностью - 80% штаммов разжижают желатин в течение 1-4 суток. Расщепляют до кислоты глюкозу и мальтозу, а часть штаммов также и сахарозу, глицерин, лактозу, галактозу, инсулин, дульцит и декстрин. Бациллы продуцируют энтеротоксины только in vivo, патогенны для белых мышей и морских свинок.

Источники и факторы передачи инфекции
Основной средой обитания Bacillus cereus является почва с нейтральной или слабощелочной реакцией. Из почвы патоген попадает в воздух, воду, пищевые продукты, на одежду и руки людей, кожные покровы животных, на поверхность оборудования пищевых предприятий. Из кишечника здоровых людей и животных Bacillus cereus выявляется редко и в небольших количествах. Размножению Bacillus cereus препятствуют кислая среда и высокая концентрация сахара. При хранении зараженной пищи в холодильнике (при 0…+4°С) патоген не размножается.

Патогенез
Пищевые токсикоинфекции проявляются при употреблении в пищу продукта, содержащего большое количество живых клеток Bacillus cereus, продуцирующих энтеротоксины. Пищевые токсикоинфекции возникают в случаях, когда живые микроорганизмы вследствие различных санитарных и технологических нарушений при приготовлении, хранении и реализации пищевых продуктов, попав в них, начинают интенсивно размножаться и при приеме пищи попадают в организм человека в больших количествах. Инкубационный период у больного колеблется от 3-4 до 10-16 ч. Болезнь возникает внезапно, сопровождается рвотой и острой диареей. Летальность менее 1% и отмечается крайне редко: у лиц с ослабленным здоровьем, главным образом у стариков и детей. Попав в желудочно-кишечный тракт, микробы по лимфатическим путям проникают в кровь, вызывая бактериемию. При этом поступившие в кровь из первичного очага микробы в ней не размножаются, а лишь транспортируются в другие органы и ткани. В клетках ретикуло-эндотелиальной системы бактерии размножаются. Продуцируемый бациллами эндотоксин поражает лимфатический аппарат кишечника, вызывая дистрофические изменения в стенках кишок. Общее недомогание обусловлено действием эндотоксина на центральную нервную систему. Последствием перенесения токсикоинфекции является бактерионосительство, причем в некоторых случаях довольно длительное. Для окружающих больные не опасны; контактное заражение отсутствует, поскольку возбудитель выделяется с рвотными массами и испражнениями непродолжительное время и обладает малой патогенностью. Клиническая картина выражается проявлениями гастроэнтерита (коликообразные боли в животе, тошнота, диарея). Энтеротоксины влияют на транспорт жидкости, электролитов и глюкозы клетками кишечника. Температура тела заболевшего человека обычно в пределах нормы, либо повышается незначительно. Более тяжелые формы заболевания сопровождаются резкой головной болью, рвотой, судорогами и даже потерей сознания. Продолжительность пищевой токсикоинфекции до 4-6 суток. На основании превалирующих симптомов пищевого отравления, вызванного Bacillus cereus, выделяют две формы заболеваний: диарейную и токсикозоподобную (рвотную). Диарейный тип пищевого отравления чаще возникает при употреблении некачественных мяса, рыбы, молока, овощей. При диарейной форме клиническая картина развивается через 24 ч после употребления инфицированного продукта. Температура, как правило, не повышается. Диарейная форма развивается при поступлении в организм больших количеств Bacillus cereus (свыше 10 6 микробных клеток), продуцирующих энтеротоксины диарейного типа. Токсикозоподобная (рвотная) форма пищевого отравления имеет чрезвычайно короткий инкубационный период 0,5-6 ч. Характеризуется тошнотой и рвотой, длящейся до 24 ч. В инфицированном продукте и рвотных массах регистрируется специфический термостабильный рвотный энтеротоксин. Возникновение конкретной формы пищевого отравления зависит от условий размножения Bacillus cereus. Рвотная форма заболевания связана, как правило, с контаминацией крупяных, картофельных и макаронных блюд, салатов, пудингов, соусов. Во всех случаях интенсивному накоплению бактерий и стимулированию токсинообразования способствует нарушение температурных условий и сроков хранения готовых к употреблению блюд и скоропортящихся продуктов. При этом интенсивное размножение Bacillus cereus в таких продуктах происходит при температуре выше 15°С.

Методы обнаружения

Классический метод
Метод основан на выделении Bacillus cereus из колоний, полученных при поверхностном посеве продукта или его разведения на селективные среды. Принадлежность выделенных колоний к Bacillus cereus определяют по морфологическим и биохимическим свойствам [ГОСТ 10444.8-88].

Бактерии – простейшая форма жизни, состоящая из одной клетки. Они очень быстро размножаются путем деления. Бактерия, созревая, делится на две клетки, в результате чего получается два микроорганизма. Весь процесс занимает примерно 20-30 минут. Потом он многократно повторяется. При такой огромной скорости, одна бактерия при идеальных условиях могла бы произвести около 33 триллионов потомков за сутки. Новые штаммы бактерий – чистые культуры, изолированные в определенное время и в определенном месте, – будут появляться очень быстро при такой скорости размножения. Но их век не так уж долог. Он составляет у различных видов от нескольких минут до пары часов, поэтому бактерии даже при идеальных условиях не могут так быстро размножаться.

Listeria monocytogenes

Эти организмы появились на земле задолго до человека, благодаря чему количество их разновидностей сейчас неимоверно велико. Для простоты изучения их подразделяют на штаммы, объединяя по свойствам и особенностям.

Чтобы понять, насколько они разнообразны, можно оценить температуры, комфортные для существования различных бактерий. Есть температура, при которой все организмы этого вида перестают быть активными и впадают в спячку. Также есть верхний порог, при котором они погибают. В промежутке между этими температурами бактерии чувствуют себя очень комфортно, ведут активную жизнедеятельность.

Так, для бактерий-сапрофитов (питающихся клетками омертвевших растений или животных), температурный диапазон совсем небольшой – от +25°С до +30°С. Для патогенных микроорганизмов, приносящих заболевания, оптимальная температура составляет +38°С. Существуют также бактерии, которые прекрасно живут и размножаются при температуре +100°С. Многообразие бактерий на Земле очень велико.

Штаммы

В микробиологии, науке, занимающейся изучением микроорганизмов (невидимых глазу особей), существует понятие штамм бактерий. Штамм – это чистая культура микроорганизмов. Так как бактерии размножаются делением, то чаще всего находят целые колонии схожих между собой микроорганизмов. Благодаря высокой скорости размножения, эти существа очень изменчивы. Поэтому нельзя вывести один и тот же штамм бактерий из одного источника дважды.

Молочнокислые бактерии

Еще с древности кисломолочные продукты получали, используя штаммы молочнокислых бактерий. Эти организмы сбраживают углеводы, образуя при этом молочную кислоту. В последнее время их не только используют для приготовления кисломолочных продуктов, но и добавляют в пищу.

Штаммы молочнокислых бактерий в основном пробиотические и сохраняют жизнеспособность при прохождении через желудочно-кишечный тракт. У них есть множество полезных свойств. Например, они проявляют активность по отношению к патогенным микроорганизмам, вырабатывая различные органические кислоты бактерицидного действия. А некоторые штаммы производят активную перекись водорода, которая разрушает вирусы.

Клубеньковые бактерии

Также выделяют штамм клубеньковых бактерий. Они заражают только бобовые растения. Клубеньковые бактерии очень специфичны. Случается, что бактерии, образующие на клубеньки корнях люпина, не заражают корни гороха или клевера. Но хоть они порой и отличаются между собой, все клубеньковые бактерии хорошо развиваются при нейтральной кислотности почвы. Их применяют в сельском хозяйстве для улучшения ценности почв и получения лучшего урожая.

Кишечная палочка

Существуют микроорганизмы, обитающие в совсем другой среде. К таким относится штамм бактерии Escherichia coli, который живет в кишечнике человека. Бактерии попадают в организм новорожденного ребенка оральным путем в течение 40 часов после появления на свет.

Кишечная палочка, так ее называют, приносит определенную пользу организму человека. Она синтезирует витамины К и В1, а также противостоит патогенным бактериям, которые время от времени появляются в нашем желудочно-кишечном тракте. Кишечная палочка используется для проведения генетических исследований благодаря тому, что может быть выделена в лаборатории. Некоторое время кишечная палочка может жить вне организма человека и животных – это позволяет делать анализы образцов на наличие фекальных загрязнений.

Мутанты

Находящиеся в стационарах болезнетворные микроорганизмы постепенно формируют госпитальные штаммы. Их основная особенность – способность быстро заражать организм. Также они полирезистентные (обладают молниеносной адаптацией к лекарственным препаратам). Госпитальные инфекции способны вызывать масштабные внутрибольничные заболевания в короткие сроки.

Среди всех микроорганизмов ученые отдельно выделяют ауксотрофов. Они отличаются тем, что не могут производить какое-либо органическое вещество, необходимое для их роста и развития. Ауксотрофы относятся к мутантам, так как не могут самостоятельно развиваться, если нужного органического вещества нет в окружающей среде. Эти штаммы используются для проведения различных исследований. Также ауксотрофы удобно использовать для генетического маркирования в микробиологии.

Понятие ауксотрофия присуще не только микробиологии. Ауксотрофными являются множество видов на Земле. Примером ауксотрофного организма можно назвать и человека – ему нужны незаменимые аминокислоты для нормального развития.

Бациллы

В русском языке можно часто встретить слово «бациллы». Под этим понятием может подразумеваться как род бактерий (лат. bacillus), так и бактерии или микроорганизмы в общем. Второй вариант чаще встречается в простой речи. На самом деле бациллы – это грамположительные спорообразующие бактерии, имеющие вид изогнутых палочек.

Самые известные из них – это:

Bacillus anthracis, который является возбудителем сибирской язвы;
Bacillus subtilis, называемый также сенной палочкой;
Bacillus cereus – вызывает токсические инфекции у человека, следствием которых являются рвота или диарея.

Польза бацилл

Стоит отметить, что среди бацилл есть микроорганизмы, поддерживающие оптимальную микрофлору в нашем кишечнике. Штаммы бацилл также используются как активные пробиотики. Их можно найти в различных лекарственных препаратах и БАДах. Так, в России можно встретить БАДы, включающие Bacillus subtilis. Примерами использования полезных свойств бацилл являются препараты Бактистатин и Киндер гель. В США компания выпускает штамм Bacillus coagulans, который используется для производства препарата Sustenex.

Бациллы используются в сельском хозяйстве, так как продуцируют антибиотики и обладают способностью закислять почву. Они эффективно противодействуют многим микроорганизмам, таким как сальмонелла, протей, стрептококки, а кроме того – производят аминокислоты и витамины, которые необходимы растениям. Такие штаммы, как Bacillus subtilis и licheniformis успешно используются для получения α-амилазы и протеинов (важных составляющих ферментативных препаратов)

Cereus IP 5832

Bacillus cereus IP 5832 – это непатогенный живой микроорганизм. Его используют как главное действующее вещество для получения препаратов, восстанавливающих оптимальную микрофлору кишечника. Некоторые его особенности:

Cereus IP 5832 противодействует болезнетворным микроорганизмам и способствует нормализации пищеварения.
Bacillus cereus IP 5832 присутствует в лекарствах в виде спор, которые устойчивы к действию кислоты и пепсина желудка.
Уже в кишечнике споры Cereus IP 5832 превращаются в полноценные микроорганизмы путем созревания.
Cereus IP 5832 генетически близка к сенной палочке.
Штамм Bacillus cereus IP 5832 сопротивляется многим антибиотикам широкого спектра и восстанавливает нормальную микрофлору кишечника.

Cereus IP 5832 при нормальном развитии не должна находиться в кишечнике человека, поэтому через 4 суток после применения препаратов, содержащего споры бактерии, она выводится естественным путем.

Сенная палочка

Bacillus subtilis – один из самых исследованных микроорганизмов. Основные свойства:

Размножается делением или спорами.
Subtilis представляет собой бесцветную прямую палочку с закругленными тупыми краями.

Бацилла впервые была выведена в 1835 году путем выделения из отвара сена, поэтому и получила свое название.

Благодаря Bacillus subtilis были изучены механизмы спорообразования бацилл, работа жгутика микроорганизмов, исследованы генетические изменения, происходящие у бактерий в космосе или условиях, близких к невесомости.

Сенная палочка

Subtilis, как и другие бациллы, обладает способностью подавлять патогенные микроорганизмы. Именно поэтому хищные животные иногда употребляют в пищу некоторые виды растений, в которых можно встретить сенную палочку.

Bacillus subtilis часто среди первых появляется в ране человека. Она вырабатывает антибиотики, негативно влияющие на развитие болезнетворных микроорганизмов, и оказывает противоаллергическое воздействие. Subtilis угнетает большинство возбудителей хирургических инфекций.

Микроорганизмы незаметны для нас, но они играют очень важную роль в жизнедеятельности всех экосистем планеты. Бактерии производят органические вещества, витамины, убивают патогенные микроорганизмы. Мы можем использовать их свойства для создания многих полезных вещей. И тогда то, что сегодня кажется фантастикой, завтра будут применяться повсеместно.

Работаю врачом ветеринарной медицины. Увлекаюсь бальными танцами, спортом и йогой. В приоритет ставлю личностное развитие и освоение духовных практик. Любимые темы: ветеринария, биология, строительство, ремонт, путешествия. Табу: юриспруденция, политика, IT-технологии и компьютерные игры.

Исследование воздействия ампициллина на морфологические и механические свойства клеток Escherichia coli и Bacillus cereus с использованием метода атомно-силовой микроскопии

Д. Г ДЕРЯБИН, А. С. ВАСИЛЬЧЕНКО, А. Н. НИКИЯН

Оренбургский государственный университет

Investigation of Ampicillin Effect on Morphological and Mechanical Properties of Escherichia coli and Bacillus cereus Cells with Atomic Force Microscopy

D. G. DERYABIN, A. S. VASILCHENKO, A. N. NIKIYAN Orenburg State University, Orenburg

Методом атомно-силовой микроскопии изучено влияние суббактериостатических концентраций ампициллина на морфологические и механические свойства клеток грамотрицательного (Escherichia coli K12 TG1) и грамположительного (Bacillus cereus IP5832) микроорганизмов. Показана выраженная гетерогенность бактериальных популяций по характеру реагирования на воздействие антибиотика. Общим моментом являлось увеличение размера клеток, что может быть обусловлено действием внутреннего осмотического давления на снизившую свою прочность клеточную стенку. Помимо этого в популяции E.coli обнаружены аномально удлинённые клетки с признаками нарушения септирования, а также происходящие от них структуры, утратившие жидкую фракцию цитоплазматического содержимого. В свою очередь у B.cereus действие внутреннего осмотического давления преимущественно вело к увеличению поперечного сечения клетки, изменяя её форму от палочки к сфере, что сопровождалось выраженным нарушением структурированности поверхности с освобождением фрагментов пептидогликана в окружающую среду. В качестве причины наблюдаемых особенностей реагирования E.coli K12 TG1 и B.cereus IP5832 на воздействие ампициллина названы различия в строении их клеточных стенок, в том числе обусловленные особенностями синтеза и трёхмерной организации пептидогликана.

Ключевые слова: ампициллин, Escherichia coli, Bacillus cereus, атомно-силовая микроскопия, морфологические и механические характеристики бактериальной клетки.

The effect of subbacteriostatic concentrations of ampicillin on morphological and mechanical properties of gramnegative and grampositive cells of Escherichia coli K12 TG1 and Bacillus cereus IP 5832 respectively was studied with atomic force microscopy. Significant heterogeneity of the bacterial populations was shown by the character of the response to the antibiotic effect. The common feature was increase of the cell size likely due to the effect of the inner osmotic pressure on the lowered cell wall strength. In the E.coli population there were besides observed anomalous elongated cells with signs of septation disorder, as well as their structurs, lacking the cytoplasmic liquid fraction. In the B.cereus the inner osmotic pressure mainly enlarged the cell cross section, changing the cell shape from rod to sphere, that was accompanied by significant impairment of the surface structure with liberation of the peptidoglycane fragments to the medium. The particular features of the E.coli K12 TG1 and B.cereus IP 5832 respond to the ampicillin effect were attributed to the differences in the structure of their cell wall, also due to specific properties of the peptidoglycane synthesis and three-dimensional organization.

Key words: ampicillin. Escherichia coli, Bacillius cereus, atomic force microscopy bacterial, cell morphological and mechanical characteristics.

Введение

термальные клетки-мишени . В качестве одного из подобный методов в настоящее время рассматривается атомно-силовая микроскопия (АСМ), разработанная Г. Биннигом и К. Гербе-ром в 1986 г. и основанная на оценке взаимодействия упругого зонда (кантилевера) с поверхностью исследуемого образца . По сравнению с растровой электронной микроскопией АСМ имеет ряд значимых преимуществ, заключающихся в более высоком разрешении, возможнос-

Совершенствование традиционных и создание новых препаратов с антимикробной активностью требует использования широкого арсенала методов, позволяющих комплексно оценивать механизмы и последствия их воздействия на бак-

E-mail: [email protected]

ти получения представлений об истинных трёхмерных характеристиках объекта, нетребовательности к созданию вакуума и нанесению на образец металлического покрытия . Последнее обстоятельство определило уникальную возможность использования АСМ для изучения морфологических и механических свойств клеток про- и эукариотов из живого состояния.

Сказанное объясняет высокую востребованность АСМ для визуализации последствий воздействия различных препаратов на модельные микроорганизмы . При этом в ряде подобных работ в качестве «препарата сравнения» используется антибиотик ампициллин, по отношению к которому оцениваются эффекты вновь создаваемых веществ и соединений . Кроме того, самостоятельное значение имеет и детализация механизмов биологической активности самого ампициллина, по-прежнему занимающего заметное место в арсенале современной антибио-тикотерапии .

В этой связи целью настоящей работы явилось экспериментальное изучение воздействия ампициллина на морфологические и механические свойства клеток модельных грамотрицатель-ного (Escherichia coli) и грамположительного (Bacillus cereus) микроорганизмов, реализованное с использованием метода атомно-силовой микроскопии.

Материал и методы

При проведении работы использованы музейные штаммы Escherichia coli K12 TG1 и Bacillus cereus IP 5832. В зависимости от этапа эксперимента культивирование данных микроорганизмов проводилось на LB-агаре или LB-бульоне («Sigma-Aldrich», США) при 37°С.

При определении суббактериостатических концентраций ампициллина (ОАО «Биохимик», Россия) его навески в количестве 5 мг растворяли в 5 мл LB-бульона, из которого готовили серии двукратных разведений с содержанием антибиотика от 1 мг/мл до 20 пг/мл. В качестве контроля использовали идентичную среду культивирования без действующего агента. Исходные культуры E.coli K12 TG1 и B.cereus IP 5832 выращенные в течение 18-24 ч на LB-агаре суспендировали до оптической плотности 0,5 ед. при 620 нм. Полученной суспензией в объёме 5 мкл инокулировали 2,5 мл LB-бульона с различным содержанием ампициллина, инкубировали в течение 18-24 часов, после чего оценивали наличие роста визуально, а также по поглощению при 620 нм. Определённые подобным образом суббактериостатические концентраций ампициллина составили для E.coli K12 TG1 7,8 мкг/мл, а для B.cereus IP 5832 0,1 нг/мл.

Выращенные в присутствии ампициллина (опыт) и в его отсутствии (контроль) микроорганизмы отмывали центрифугированием при 4000 об/мин в дистиллированной воде, после чего в объёме 10 мкл наносили на свежий скол слюды и высушивали в течение 24 ч при относительной влажности 95% и температуре 20-22°С в соответствии с ранее предложенной процедурой . Полученные образцы исследовали методом атомно-силовой микроскопии в контактном режиме с использованием мульти-ми-кроскопа SMM-2000 (ЗАО «КПД», Россия). В процессе сканирования использовались кантилеверы MSCT-AUNM («Park Scientific Instruments», США) с жесткостью балки 0,01 Н/м и ра-

диусом кривизны иглы порядка 15-20 нм. Количественный морфометрический анализ полученных изображений проводили с использованием штатного программного обеспечения микроскопа. Исследование упругих свойств бактериальных клеток проводили путём анализа силовых кривых, описывающих зависимость изгиба балки кантилевера от расстояния между иглой зонда и поверхностью исследуемого образца. На данной основе рассчитывали величину силы, необходимую для деформации образца на заданную величину и характеризующую упругость объекта .

Полученные результаты обработаны методами вариационной статистики с использованием модульной программы «Attestat», работающей в среде MS Excel.

Результаты и обсуждение

Использование атомно-силовой микроскопии позволило представить каждый из исследуемых объектов в виде трёхмерных сканов, содержащих информацию о длине, ширине и высоте бактериальных клеток, на основании чего дополнительно были рассчитаны площадь их сечения, а также объём подобных объектов. Помимо этого с высоким разрешением был оценен показатель шероховатости (профиль) поверхности бактериальных клеток, а также их упруго-механические свойства.

При АСМ интактных клеток E.coli K12 TG1 (рис. 1, а) последние обнаруживались как палочковидные объекты с закругленными концами, размерные характеристики которых составляли 2,46±0,34 мкм по длине, 1,24+0,27 мкм по ширине и 0,20+0,03 мкм по высоте. Соответственно рассчитанные на этой основе величины площади сечения и объёма бактериальных клеток равнялись 0,20+0,07 мкм2 и 0,48+0,16 мкм3. На некоторых сканах были визуализированы отходящие от поверхности клеток ворсинки и одиночные пери-трихиально расположенные жгутики. Измеренный профиль бактериальной поверхности (рис. 1, б) позволил зафиксировать величины шероховатости интактных клеток E.coli K12 TG1 на уровне 2,26+0,59 нм, а измененные величины их упругости характеризовались величиной 2,74+1,79 МПа, примерно соответствующей таковой, ранее установленной для клеток других грамотрица-тельных микроорганизмов .

В свою очередь интактные клетки B.cereus IP 5832 визуализировались как расположенные цепочками палочки с «обрубленными» концами (рис. 1, в), при морфометрическом анализе имеющие длину 4,40+0,94 мкм, ширину 1,53+0,39 мкм и высоту 0,47+0,06 мкм. Соответственно рассчитанные на этой основе величины площади их сечения и объёма равнялись 0,57+0,17 мкм2 и 2,50+0,86 мкм3. У единичных клеток обнаруживались по 1-2 полярно расположенных жгутика. Сканирование бактериальной поверхности (рис. 1, г) показало значения шероховатости, равные 2,71+0,75 нм, а исследование механических свойств клеток оценивало их упругость величи-

Рис. 1. Фазовые АСМ-изображения (а, в) и профили поверхностей (б, г) интактных клеток E.coli K12 TG1 (а, б) и B.cereus IP 5832 (в, г).

ной 2,54±0,78 МПа. В целом, по сравнению с E.coliK12 TGI, клетки B.cereus IP 5832 могли быть охарактеризованы как значительно более крупные объекты, имеющие несколько большую шероховатость, но меньшую упругость поверхности при механическом воздействии. При этом в основе выявленных различий лежит принадлежность B.cereus IP 5832 к отделу Firmicutes, классу Bacilli, порядку Bacilliales с характерным для грамполо-жительных эубактерий строением поверхностных клеточных структур, а также родовые, видовые и штаммовые особенности исследуемого микроорганизма.

Результаты исследования морфологических и механических свойств клеток E.coli K12 TG1, выросших в присутствии суббактериостатической концентрации ампициллина, констатировали выраженную гетерогенность бактериальной по-

пуляции по характеру её реагирования на подобное воздействие (рис. 2, а). Так, 92,04±4,3% клеток (в таблице обозначены как объекты 1-го типа) в значительной степени сохраняли свою морфологию по сравнению с интактными микроорганизмами, оказываясь несколько более тонкими (1,00±0,34 мкм; р<0,01), но удлинёнными до 3,40±0,72 мкм (р<0,01) образованиями, одновременно несколько увеличивающими свой объём до 0,54±0,23 мкм3. При этом возможной причиной подобных изменений могло являться «растягивающее» действие внутреннего осмотического давления на снизившую свою ригидность клеточную стенку. Этим же может объясняться и более низкая остаточная упругость инкубированных в контакте с ампициллином клеток Е.соИ К12 Т01, в данном случае характеризуемая величиной 2,03±1,54 МПа. В то же время шерховатость по-

Рис. 2. Фазовые АСМ-изображения (а-г) и профили поверхностей (д, е) клеток E.coli K12 TG1 (а, б, д) и B.cereus IP 5832 (в, г, е), инкубированных в контакте с суббактериостатическими концентрациями ампициллина.

добных объектов существенно не отличалась от контрольных величин, что связано с зависимостью этого параметра от свойств наружной мембраны исследуемого грамотрицательного микроорганизма, не имеющей молекулярных мишеней для воздействия ампициллина.

На этом фоне до 7,96+4,3% визуализированных объектов было представлено аномально удлиненными образованиями с признаками нарушения септирования (в таблице обозначены как объекты 2-го типа). В данном случае при относительной неизменности ширины и высоты, их длина (18,52+8,66 мкм) и объём (3,88+2,18 мкм3) в 6,7-7,7 раз превышали таковые у интактных клеток (^<0,01). Природа же зарегистрированных изменений может быть обусловлена высоким сродством ампициллина к пенициллинсвязыва-ющему белку (англ. - РВР) 3 типа, контролирующему процесс формирования межклеточных перегородок при делении .

Наконец, ещё одним проявлением гетерогенности популяции Е.еоН К12 Т01 по её чувствительности к воздействию ампициллина явились обнаруживаемые на единичных сканах клеточные структуры с признаками утраты жидкой фракции цитоплазматического содержимого (рис. 2, б; в таблице обозначены как объекты 3-го типа). Последние визуализировались как заполнен-

ные гранулярным материалом уплощённые образования, по своей высоте (0,08+0,03 мкм; /><0,01) и площади сечения (0,09+0,03 мкм2; ^<0,01) более чем в два раза уступающие сохранившим свою целостность бактериальным клеткам. Их дополнительными особенностями также являлись значительно более высокие показатели шероховатости (13,32+4,85 нм; ^<0,01), а также характеризуемая модулем Юнга жесткость (6,66+5,11 МПа; /><0,01). В целом проведённый морфометрический анализ позволял предполагать утрату жизнеспособности подобных образований, а их значительная длина свидетельствовала в пользу их происхождении от описанных выше аномально удлинённых клеток, имеющих выраженное нарушение процесса септирования.

Не менее выраженной при культивировании в контакте с суббактериостатической концентрацией ампициллина оказывалась и гетерогенность популяции В.еегеш 1Р 5832. При этом клетки, находящиеся в одной микроколонии могли быть представлены как частично сохранившими свою морфологию удлинёнными палочковыми формами, так и существенно изменившими её клетками, форма которых стремилась к шаровидной (рис. 2, в; в таблице обозначены как объекты 1-го типа). При этом у последних зарегистрировано достоверное

Морфологические и механические характеристики клеток E.coli М2 TG1 и B.cereus № 5832 до и после воздействия суббактериостатических концентраций ампициллина

Штамм Исследуемые Морфологические характеристики Механические

группы*** длина ширина высота площадь объём шерохо- характеристики

(мкм) (мкм) (мкм) сечения (мкм2) (мкм3) ватость модуль

(нм) Юнга (МПа)

Е.соИ К 12 Т01 Контроль 2,46+0,34 1,24+0,27 0,20+0,03 0,20+0,07 0,48+0,16 2,26+0,59 2,74+1,79

Объекты 1 типа 3,40+0,72 ** 1,00+0,34 ** 0,20+0,02 0,16+0,06 ** 0,54+0,23 2,06+0,56 2,03+1,54

Объекты 2 типа 18,52+8,66** 1,30+0,19 0,21+0,03 0,21+0,05 3,88+2,18** 2,25+0,40 3,50+2,18

Объекты 3 типа 11,87+8,01** 1,42+0,20** 0,08+0,03** 0,09+0,03** 1,07+0,83** 13,32+4,85** 6,66+5,11**

Б.сегеш 1Р 5832 Контроль 4,40+0,94 1,53+0,39 0,47+0,06 0,57+0,17 2,50+0,86 2,71+0,75 2,21+1,58

Объекты 1 типа 2,59+0,59** 3,04+0,72** 0,88+0,18** 2,14+0,82** 5,55+2,72** 8,72+2,66** 5,45+3,27**

Объекты 2 типа 3,54+0,80** 2,32+0,61** 0,37+0,09** 0,68+0,30 2,40+1,45* 11,37+3,54** 0,23+0,09**

Примечание. * - р<0,05 (критерий Уилкоксона); ** - р<0,01 (критерий Уилкоксона); *** - пояснения в тексте.

уменьшение длины (до 2,59+0,59 мкм; р<0,01) при одновременном увеличении ширины и высоты до 3,04+0,72 мкм и 0,88+0,18 мкм соответственно (^<0,01). Названные причины обусловили и выраженное увеличение величин площади сечения, а также объёма подобных клеток, составляющего 5,55+2,72 мкм3 (^<0,01) и более чем в два раза превышающего таковой у интактных клеток. При этом вновь в качестве возможной причины подобных изменений могло быть названо растяжение изменившей свою ригидность клеточной стенки под действием внутреннего осмотического давления.

С другой стороны, в противоположность эффектам, зарегистрированным при исследовании эффектов ампициллина на клетки Е.соН К12 Т01, воздействие на Б.сегеш 1Р 5832 вело к существенному изменению показателя шероховатости поверхности, объясняемой экспонированием на ней основной мишени для действия антибиотика. Соответственно обусловленное воздействием ампициллина нарушение трёхмерной пространственной структуры пептидогликана результирова-лось в более чем трёхкратном увеличении шероховатости (до 8,72+2,66 нм; р<0,01) клеток В.сегет 1Р 5832, инкубированных в контакте с ампициллином.

На тех же сканах до 45,37+22,6% клеток (в таблице обозначены как объекты 2-го типа) визуализировались как уплощённые до 0,37+0,09 мкм (р<0,01) образования с характеризуемой модулем Юнга упругостью 0,23+0,09 МПа, что позволяло оценивать их как клетки, утратившие значительную часть внутриклеточного содержимого. При этом дополнительными особенностями подобных объектов являлась еще более выраженная (до 11,37+3,54 нм; р<0,01) шероховатость поверхности, сопровождающаяся расположением вокруг них гранулярных структур размером 261,2+139,0 нм, предположительно представляющих собой фрагменты пептидогликана, освобождённые во внешнюю среду при нарушении целостности клеточной стенки (рис. 2, г).

Заключение

Таким образом, использование атомно-сило-вой микроскопии позволило детально охарактеризовать гетерогенность популяции Е.соН К12 Т01 и В.сегет 1Р 5832 после контакта с суббактериоста-тической концентрацией антибиотика ампициллина, оценить спектр изменений морфологических и механических свойств клеток, а также констатировать гибель некоторых из них при подобном воздействии. Наиболее общим изменением, характерным для обоих использованных микроорганизмов, оказывалось увеличение размера клеток после контакта с ампициллином, предположительно обусловленного действием внутреннего осмотического давления на снизившую свою прочность клеточную стенку. Так, у Е.соН К12 Т01 подобный эффект преимущественно проявлялся через элонгацию клеток, в своих крайних проявлениях приводящем к формированию аномально удлинённых объектов с признаками нарушения сеп-тирования. В свою очередь у В.сегет 1Р 5832 действие внутреннего осмотического давления преимущественно вело к увеличению поперечного сечения клетки, изменяя её форму от палочки к сфере. Кроме того, обусловленная действием антибиотика выраженная дезорганизация поверхностных клеточных структур данного микроорганизма сопровождалась освобождением фрагментов пептидогликана в окружающую среду. При этом вероятной причиной особенностей реагирования Е.соН К12 Т01 и В.сегет 1Р5832 на воздействие ампициллина являются различия в строении их клеточных стенок, в том числе обусловленные особенностями синтеза и трёхмерной организации пептидогликана.

Полученные результаты позволяют по-новому оценить последствия воздействия антибиотика ампициллина на клетки модельных грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, связав их с ранее охарактеризованными механизмами его биологической активности и известными молекулярными мишенями. С другой стороны, для дальнейшей

оценки методом ACM известных и вновь синтезируемых соединений, направленных на нарушение синтеза пептидогликана, проведённые исследования позволяют рекомендовать грампо-ложительные микроорганизмы, экспонирующие данный биополимер непосредственно на своей поверхности. В свою очередь грамотрицательные микроорганизмы представляются модельными объектами, адекватными для использования ACM при оценке биологической активности

ЛИТЕРАТУРА

1. Finberg R. V., Moellering R. C, Tally F. P. The Importance ofbacterici-dal drugs: future directions in infectious disease. Clin Infect Dis 2004; 39: 1314-1320.

2. Binnig G, Quate C. F, Gerber Ch. Atomic force microscope. Phys Rev Lett 1986; 6: 59: 930-933.

3. Dufrêne Y. F. Atomic force microscopy, a powerful tool in microbiology. J Bacteriol 2002; 184: 19: 5205-5213.

4. Camesano T. A., Natan M. J., Logan B. E. Observation of changes in bacterial cell morphology using tapping mode atomic force microscopy. Langmuir 2000; 16: 4563-4572.

5. Олюнина Л. H, Мацкова Ю. А., Гончарова Т. А., Гущина Ю. Ю. Оценка терморезистентности Azotobacter chrococcum методом атомно-силовой микроскопии. Приклад биохим микробиол 2009; 45: 1: 45-50.

6. Perry C. C., Weatherly M., Beale T., Randriamahefa A. Atomic force microscopy study of the antimicrobial activity of aqueous garlic versus ampicillin against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. J Sci Food Agric 2009; 89: 958-964.

мембраноповреждающих факторов. Наконец, сама атомно-силовая микроскопия, являющаяся принципиально новым методом визуализации микрообъектов с нанометровым разрешением, может быть охарактеризована как информативный подход, позволяющий при минимальном дополнительном воздействии на анализируемый образец получать уникальную информацию о последствиях воздействия антибактериальных факторов на модельные микроорганизмы.

7. Yang L, Wang K, Tan W. et al. Atomic force microscopy study of different effects of natural and semisynthetic /в-lactam on the cell envelope of Escherichia coli. Anal Chem 2006; 78: 7341-7345.

8. Рачина С. А., Козлов P. С., Шаль E. П. и др. Анализ антибактериальной терапии госпитализированных пациентов с внебольничной пневмонией в различных регионах: уроки многоцентрового фар-макоэпидемиологического исследования. Клин микробиол антимикроб химиотер 2009; 11: 1: 66-78.

9. Nikiyan A., Vasilchenko A., Deryabin D. Humidity-dependent bacterial cells functional morphometry investigations using atomic force microscope. Intern J Microbiol 2010; Article ID 704170, doi:10.1155/2010/704170.

10. Голутвин И. А., Насикан И. С., Игнатюк Т. E. Новые подходы к исследованию вирусов при помощи сканирующей зондовой микроскопии. Биофизика. 2004; 49: 6: 1105-1111.

11. Salerno M., Bykov /.Tutorial: mapping adhesion forces and calculating elasticity in contact-mode AFM. Microscopy and Analysis 2006; 20: S5-S8.

12. Spratt B. G. Distinct penicillin binding proteins involved in the division, elongation, and shape of Escherichia coli K12. Proc Nat Acad Sci USA 1975; 72: 8: 2999-3003.

Оглавление темы "Возбудитель сибирской язвы. Клинические проявления заражения сибирской язвой. Bacillus cereus.":

Bacillus cereus. Морфология bacillus cereus. Культуральные свойства bacillus cereus. Клиника отравлений bacillus cereus. Принципы микробиологической диагностики bacillus cereus. Выявление bacillus cereus.

Bacillus cereus - почвенная бактерия-сапрофит, широко распространённая в природе. Нередко бактерии обсеменяют пищевые продукты, вызывая пищевые отравления. Явления интоксикации опосредует энтеротоксин. Его образуют бактерии, прорастающие из спор, устойчивых к определённым термическим режимам обработки пищевых продуктов (обычно овощей). Бактерии образуют токсины только in vivo, во время прорастания спор. В последние годы также отмечены госпитальные инфекции, спорадически вызываемые В. cereus, - бактериемии, эндокардиты и менингиты у лиц с протезированными органами, катетерами, у пациентов с гемодинамическими нарушениями, а также у длительно получавших цитостатики и иммунодепрессанты. Поражения протекают тяжело и часто заканчиваются фатально.

Морфология и культуральные свойства bacillus cereus

Морфологически bacillus cereus напоминает сибиреязвенную палочку; основные отличия - подвижность и гемолитическая активность. В мазках бактерии располагаются в виде штакетника. Температурный оптимум роста 30 °С; оптимум рН 7-9,5. На агаре возбудитель образует «распластанные» колонии с неровными краями; на КА колонии окружены широкой зоной гемолиза (см. рис. 4 на вклейке). Со временем колонии приобретают характерный восковидный вид [от лат. сега, воск, свеча]. В жидких средах образуют нежную плёнку на поверхности, белый хлопьевидный осадок и помутнение бульона. Бактерии проявляют высокую протеолитическую активность и разжижают желатину за 1-4 сут; все штаммы образуют лецитиназу и ацетоин. Образуют кислоту на средах с глюкозой и мальтозой.

Клинические проявления отравлений bacillus cereus

Bacillus cereus вызывает два типа пищевых отравлений (гастроэнтеритов).

Отравления bacillus cereus первого типа отличает укороченный инкубационный период (около 4-5 ч); характерны изнуряющие диарея и рвота. Заболевание развивается при употреблении пищи, обсеменённой большим количеством микроорганизмов.

Отравления bacillus cereus второго типа отравлений отличает более продолжительный инкубационный период (около 17 ч). Больные жалуются на схваткообразные боли в животе, диарею. Этот комплекс симптомов часто ошибочно принимают за пищевые отравления, вызванные клостридиями.

Принципы микробиологической диагностики bacillus cereus

Диагностическим признаком bacillus cereus считают обнаружение в подозрительных пищевых продуктах более 10 5 бактерий в 1 г/мл продукта либо 10 2 -10 3 бактерий в 1 г/мл каловых и рвотных масс или промывных вод. Основные отличия В. cereus от В. anthracis - гемолитическая активность, подвижность, резистентность к пенициллину, быстрое разжижение желатины и непатогснность для белых мышей.

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии, и может использоваться в бактериологических лабораториях для выявления антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893). Осуществляют совместную инкубацию в физиологическом растворе выделенного штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в чистой культуре и выделенной чистой культуры условно-патогенного микроорганизма (УПМ) из фекалий пациента. Полученную смесь высевают по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл и без него, и при выявлении снижения количества УПМ на среде с пенициллином по сравнению с количеством УПМ на среде без него определяют наличие антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штамма УПМ, при этом эубиотик оценивают как эффективный в отношении штамма УПМ, выделенного от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника. Изобретение обеспечивает подавление штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) без ущерба для всхожести тест-культур УПМ. 3 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии, и может использоваться в бактериологических лабораториях для выявления антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) с целью индивидуальной оценки эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является штамм Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника. Изобретение может быть использовано также в гастроэнтерологии для индивидуального подбора эубиотиков, основным действующим началом которых является штамм Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893), при лечении дисбактериоза кишечника.

Среди препаратов для коррекции измененного микробиоценоза кишечника важное место занимают эубиотики, предназначенные для подавления патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Наиболее часто в состав эубиотиков входят представители рода Bacillus, которые не являются представителями нормальной микрофлоры кишечника, элиминируются вскоре после отмены и являются мощными антагонистами неродственных микроорганизмов за счет продукции лизоцима, протеолитических ферментов и бактериоцинов . Известно, что наиболее эффективно бациллы подавляют патогенные энтеробактерии и некоторые условно-патогенные микроорганизмы, колонизирующие кишечный биотоп: S. aureus, Candida spp., E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae и другие условно-патогенные энтеробактерии .

Одним из наиболее широко применяемых эубиотических препаратов во многих странах является препарат «Бактисубтил» (Франция), основным действующим началом которого является Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893) . Известен также эубиотик «Флонивин», основным действующим началом которого также является Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893), БС Производитель Galenika, A.D., Serbia.

Производственные штаммы рода Bacillus не формируют биопленок, поскольку их адгезивные свойства к эпителиальным клеткам кишечника слабо выражены. Исходя из того, что активность штамма Bacillus cereus осуществляется в просвете кишечника и связана, прежде всего, с высокой антагонистической активностью данного штамма, а не с конкурентными взаимоотношениями за места прикрепления к слизистой , то об эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при диагностике дисбактериоза кишечника, можно судить по наличию или отсутствию антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893).

Бактериоцины или бактериоциноподобные субстанции продуцируются бациллами преимущественно экстрацеллюлярно и способны накапливаться в питательной среде . Благодаря этому, теоретически антагонистическую активность бацилл можно выявить с использованием различных модификаций методов прямого или отсроченного антагонизма, традиционно используемых лишь для выявления антагонизма пробиотических лакто- и бифидобактерий: методом штрихов , методом отсроченного антагонизма по Фредерику с промежуточной убивкой штамма-продуцента хлороформом , методом двуслойного агара .

Для выявления антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) нами использовались вышеперечисленные методики.

Для оценки антагонистической активности бацилл методом прямого антагонизма по диаметру чашки Петри с питательным агаром штрихом засевали суспензию суточной культуры B.cereus в концентрации 1×10 9 по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Перпендикулярно подсевали культуры условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза кишечника. Инкубировали при 37°С 24 часа. Наличие антагонистической активности учитывали по наличию задержки роста тест-штаммов.

При оценке антагонистической активности бацилл методом отсроченного антагонизма тест-культуры условно-патогенных микроорганизмов засевали через 24 и 48 ч после посева бацилл.

В рассмотренных вариантах оценки антагонизма штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), по собственным данным, штамм не проявлял антагонистической активности в отношении тест-культур условно-патогенных микроорганизмов (80 штаммов). Некоторые активно подвижные штаммы условно-патогенных микроорганизмов (P. aeruginosa, E. coli) росли на поверхности бациллярных колоний.

Считается, что метаболиты бацилл оказывают более мощное антагонистическое действие, нежели живые культуры . Поэтому нами была также использована методика отсроченного антагонизма с промежуточной убивкой штамма-продуцента хлороформом . Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893) засевали уколом в застывший 1,5% питательный агар, разлитый в чашки Петри, выращивали 48 часов при 37°С. После инкубации полученную культуру убивали парами хлороформа и наслаивали суспензию тест-культуры условно-патогенного микроорганизма. Для этого смешивали 0,1 мл культуры в конечной концентрации 10 8 клеток по оптическому стандарту мутности с 2,5-3 мл растопленного и остуженного до температуры 46-48°С 0,7% полужидкого агара. При наличии способности продуцировать бактериоцины должна наблюдаться зона ингибиции роста тест-штамма вокруг колонии штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893). Антагонистическая активность бацилл не выявлена, т.к. отмечался рост тест-культур УПМ «газоном» на поверхности среды с предполагаемыми бактериоцинами.

Аналогичные данные нами были получены методом модифицированного двуслойного агара с посевом бацилл газоном с последующей убивкой и наслаиванием тест-культуры УПМ.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является метод перевернутого агара, который описан для выявления антагонистической активности пробиотиков, содержащих Bacillus subtilis и Escherichia coli, в отношении оппортунистических дрожжей . Для этого штаммы Bacillus subtilis и Escherichia coli засевают газоном на плотную питательную среду, через 2 суток агар переворачивают и на его обратную сторону засевают предварительно оттитрованную посевную дозу дрожжей. Инкубируют 24 ч в аэробных условиях при 37°С. Наличие антагонизма выявляют количественно по подавлению роста дрожжей по сравнению с аналогичным посевом без пробиотических штаммов.

Метод перевернутого агара описан и протестирован для оценки антифунгального действия пробиотиков, содержащих Bacillus subtilis и Escherichia coli. Но оценка антагонистического влияния на другие условно-патогенные микроорганизмы (не оппортунистические дрожжи) не производилась. Кроме этого, оригинальная методика подразумевает подбор посевной дозы дрожжей, при которой на агаре вырастало бы не более 70 колоний. Это требует подтитровки и дополнительных исследований при тестировании каждого штамма. Проверка данной методики с использованием эубиотического штамма-продуцента Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) и 80 тест-культур условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза кишечника, не позволила нам выявить ни одного случая антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893).

Для оценки антагонистической активности лакто- и бифидосодержащих пробиотиков также описаны методики совместного культивирования в жидкой среде с различными косвенными способами оценки , не подразумевающими последующий высев на плотную питательную среду для определения количества подавляемых УПМ.

Таким образом, ни один из известных способов выявления антагонистической активности пробиотических лакто- и бифидобактерий, по данным авторов, не позволил выявить антагонистическую активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

В литературных источниках нами также не обнаружен способ индивидуальной оценки эффективности препарата «Бактисубтил» или других эубиотических препаратов, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от конкретного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Задачей изобретения является выявление антагонистической активности Bacillus cereus штамма IP 5832 (ATCC 14893) в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных у конкретного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Техническим результатом изобретения является подавление эубиотического штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) без ущерба для всхожести тест-культур.

Технический результат достигается тем, что выделяют чистую культуру условно-патогенных микроорганизмов из фекалий обследуемого, затем выделяют Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893) в чистой культуре, после чего осуществляют совместную инкубацию штамма Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893) с каждым из штаммов условно-патогенных микроорганизмов в физиологическом растворе с последующим высевом по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл и без него, и при выявлении снижения количества условно-патогенных микроорганизмов на среде с пенициллином по сравнению с количеством условно-патогенных микроорганизмов на среде без пенициллина определяют наличие антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, при этом эубиотик оценивают как эффективный в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Способ осуществляется следующим образом:

Стандартными способами выделяют чистую культуру условно-патогенных микроорганизмов из фекалий пациента и Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893) в чистой культуре, являющийся основным действующим началом эубиотика. Нами выделялась чистая культура Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893), из эубиотика «Бактисубтил». 1 мл суспензии тест-культуры условно-патогенного микроорганизма в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 9 клеток по оптическому стандарту мутности смешивают с 1 мл суспензии Bacillus cereus в такой же концентрации. Смесь инкубируют 48 ч при 37°С. Затем осуществляют высев по Gold. Для этого проводят количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста культур обоего типа. Для исключения других возможных факторов подавления роста УПМ и бацилл (отсутствие питательной основы) параллельно проводят контрольный высев монокультур после инкубации в аналогичных условиях. Количество выросших микроорганизмов подсчитывают по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости. При выявлении более одного УПМ из фекалий больного описанную процедуру осуществляют с каждым из УПМ. При выявлении снижения количества условно-патогенных микроорганизмов на среде с пенициллином по сравнению с контрольным высевом определяют наличие антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника. Наличие или отсутствие антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) является оценочным критерием для определения эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893), в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника. При наличии антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), эубиотик оценивают как эффективный в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Существенными отличительными признаками заявляемого способа являются:

Выделяют чистую культуру условно-патогенных микроорганизмов из фекалий обследуемого;

Выделяют чистую культуру Bacillus cereus штамма IP 5832 (ATCC 14893), являющуюся основным действующим началом эубиотика;

После чего осуществляют совместную инкубацию штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) с каждым из штаммов условно-патогенных микроорганизмов в физиологическом растворе;

Последующий высев смеси на питательную среду по Gold;

Высев осуществляют на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл и без него;

При выявлении снижения количества условно-патогенных микроорганизмов на среде с пенициллином по сравнению с количеством условно-патогенных микроорганизмов на среде без пенициллина определяют наличие антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении штаммов условно-патогенных микроорганизмов;

При наличии антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении штаммов условно-патогенных микроорганизмов эубиотик оценивают как эффективный в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Причинно-следственная связь между существенными отличительными признаками и достигаемым результатом:

Индивидуальность выявления антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении условно-патогенных микроорганизмов, а в свою очередь, и индивидуальность оценки эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893) в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника, обеспечивается выделением условно-патогенных микроорганизмов в чистой культуре из фекалий обследуемого и выделением чистой культуры Bacillus cereus штамма IP 5832 (ATCC 14893) с последующей совместной инкубацией в физиологическом растворе и высевом по Gold на питательную среду.

Высев по Gold на питательную среду необходим для определения количества подавляемых УПМ.

Питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл позволяет подавлять эубиотический штамм Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), без ущерба для всхожести тест-культур, что позволяет выявлять антагонистическую активность B. cereus в отношении условно-патогенных микроорганизмов.

В качестве тест-культур изучали штаммы условно-патогенных микроорганизмов, изолированные от пациентов с дисбактериозом кишечника - по 20 изолятов S. aureus, S. epidermidis, Klebsiella spp., E. coli с типичными свойствами, E. coli с измененной ферментативной активностью, Enterobacter spp., Citrobacter spp., P. aeruginosa.

1 мл суспензии тест-культур УПМ в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 9 клеток по оптическому стандарту мутности смешивали с 1 мл суспензии Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893), в такой же концентрации. Во избежание размножения бацилл или условно-патогенных бактерий использование любых жидких питательных сред для совместной инкубации сочли нецелесообразным. Смесь инкубировали 48 ч при 37°С. Предполагалось, что в течение этого времени происходило отмирание УПМ под влиянием метаболитов бацилл. Проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold. Высевали на питательный агар с антибиотиками для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста культур обоего типа. Для исключения других возможных факторов подавления роста УПМ и бацилл (отсутствие питательной основы) параллельно проводили контрольный высев монокультур после инкубации в аналогичных условиях. Количество выросших микроорганизмов подсчитывали по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости 1 .

Для подавления роста бацилл на среде высева предварительно подобрали селективную добавку - антибиотик в концентрации подавляющей бациллы, но не угнетающей рост микроорганизмов, исходя из данных о распространенной среди тестируемых условно-патогенных бактерий (особенно энтеробактерий) устойчивости к пенициллину и стрептомицину . В растопленный и остуженный до 46-48°С питательный агар вносили разные концентрации антибиотиков. При тестировании сред со стрептомицином препарат вносили в концентрациях 1,0 ЕД/мл, 0,5 ЕД/мл, 0,25 ЕД/мл среды. Засевали 25 культур УПМ и Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893) в концентрации 10 9 клеток/мл на среды с антибиотиками и без них. Однако рост бацилл подавлялся не полностью - с 10 9 до 10 4 клеток/мл при максимальной концентрации стрептомицина 1,0 ЕД/мл среды. В то же время выделенные при диагностике дисбактериоза культуры УПМ (Klebsiella spp., Enterobacter spp., атипичные E. coli, Citrobacter spp., S. aureus) в разной степени подавлялись стрептомицином в 74 (96%) тестах (Таб.2 - Подбор антибиотика для подавления Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893) и одновременного роста условно-патогенных микроорганизмов).

При тестировании сред с пенициллином добавляли препарат в концентрациях 0,001 ЕД/мл, 0,01 ЕД/ мл, 0,1 ЕД/мл, 1,0 ЕД/мл среды. Посев и учет результатов проводили аналогично. Условно-патогенные энтеробактерии не подавлялись даже максимальной концентрацией пенициллина 1,0 ЕД/мл среды. Отмечалось более интенсивное подавление S. aureus. Приемлемый уровень всхожести условно-патогенных бактерий, включая S. aureus, при одновременном полном подавлении штамма Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893) отмечался при концентрации пенициллина 0,01 ЕД/ мл питательной среды (Табл.2 - Подбор антибиотика для подавления штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) и одновременного роста условно-патогенных микроорганизмов).

При наличии антагонистической активности Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893) в отношении условно-патогенных микроорганизмов эубиотик оценивают как эффективный в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Оценочным критерием для индивидуальной оценки эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893), в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника, нами выбрана антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893). Это объясняется тем, что активность штамма Bacillus cereus осуществляется в просвете кишечника и связана, прежде всего, с высокой антагонистической активностью данного штамма, а не с конкурентными взаимоотношениями за места прикрепления к слизистой.

Совокупность существенных отличительных признаков заявляемого способа является новой и позволяет подавлять эубиотический Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893) без ущерба для всхожести тест-культур, что, в свою очередь, обеспечивает выявление антагонистической активности эубиотического штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при исследовании на дисбактериоз кишечника от пациента, что может быть использовано при индивидуальной оценке эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Примеры конкретного выполнения:

При бактериологическом исследовании кала на дисбактериоз кишечника (№ 247) выявлен Citrobacter freundii в количестве 5×10 6 КОЕ/г.

1 мл суспензии чистой культуры Citrobacter freundii, выделенной из фекалий пациента, в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 клеток по оптическому стандарту мутности смешивали с 1 мл суспензии чистой культуры Bacillus cereus штамма IP 5832 (ATCC 14893), выделенной из эубиотика "Бактистатин", в такой же концентрации. Смесь инкубировали 48 ч при 37°С. Затем проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста культур обоего типа. Количество выросших микроорганизмов подсчитывали по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости.

В контрольном варианте концентрация Citrobacter freundii составила 10 8 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 КОЕ/г. Выявлена антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении штамма Citrobacter freundii (№ 247). Препарат «Бактисубтил» определяют как эффективный в отношении штамма Citrobacter freundii, выделенного от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

При бактериологическом исследовании кала на дисбактериоз кишечника (№ 512) выявлен S aureus в количестве 10 6 КОЕ/г.

1 мл суспензии чистой культуры S aureus, выделенной из фекалий пациента, в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 9 клеток/мл по оптическому стандарту мутности смешивали с 1 мл суспензии чистой культуры Bacillus cereus штамма IP 5832 (ATCC 14893), выделенного из эубиотика «Бактисубтил», в такой же концентрации. Смесь инкубировали 48 ч при 37°С. Затем проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста культур обоего типа. Количество выросших микроорганизмов подсчитывали по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости.

В контрольном варианте концентрация S aureus составила 5×10 6 КОЕ/г, в опытном варианте - 10 6 КОЕ/г. Антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении штамма S aureus не выявлена (№ 512). Препарат «Бактисубтил» определяют как неэффективный в отношении штамма S aureus, выделенного от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

При бактериологическом исследовании кала на дисбактериоз кишечника (№ 429) выявлены Klebsiella pneumoniae в количестве 10 4 КОЕ/г, Enterobacter agglomerans в количестве 10 6 КОЕ/г, Citrobacter freundii в количестве 10 6 КОЕ/г, Staphylococcus aureus в количестве 10 4 КОЕ/г.

1 мл суспензии чистой культуры каждого из выделенных от пациента штаммов условно-патогенных микроорганизмов, в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 9 клеток по оптическому стандарту мутности смешивали с 1 мл суспензии чистой культуры Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893), выделенного из эубиотика «Бактисубтил», в такой же концентрации. Таким образом получили 4 смеси штаммов условно-патогенных микроорганизмов и бацилл. Смеси инкубировали 48 ч при 37°С. Затем проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста каждой из выделенных культур. Количество выросших микроорганизмов подсчитывали по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости.

В контрольном варианте концентрация Klebsiella pneumoniae составила 10 8 КОЕ/г, в опытном варианте 10 6 КОЕ/г. В контрольном варианте концентрация Enterobacter agglomerans составила 10 7 КОЕ/г, в опытном варианте 10 5 КОЕ/г. В контрольном варианте концентрация Staphylococcus aureus составила 10 8 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 6 КОЕ/г. В контрольном варианте концентрация Citrobacter freundii составила 10 7 КОЕ/г, в опытном варианте 10 6 КОЕ/г.

Выявлена антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штаммов Klebsiella pneumoniae, Enterobacter agglomerans, Staphylococcus aureus, Citrobacter freundii. Препарат «Бактисубтил» определяют как эффективный в отношении данных штаммов, выделенных от данного пациента при исследовании на дисбактериоз.

При бактериологическом исследовании кала на дисбактериоз кишечника (№ 449) выявлены Enterobacter agglomerans в количестве 10 6 КОЕ/г, Klebsiella pneumoniae в количестве 5×10 4 КОЕ/г, Citrobacter freundii в количестве 10 6 КОЕ/г.

1 мл суспензии чистой культуры каждого из выделенных штаммов условно-патогенных микроорганизмов в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 9 клеток по оптическому стандарту мутности смешивали с 1 мл суспензии чистой культуры Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893), выделенного из эубиотика «Бактисубтил», в такой же концентрации. Таким образом получили 3 смеси штаммов условно-патогенных микроорганизмов и бацилл. Смеси инкубировали 48 ч при 37°С. Затем проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/ мл для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста каждой из выделенных культур. Количество выросших микроорганизмов подсчитывали по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости.

В контрольном варианте концентрация Enterobacter agglomerans составила 10 8 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 7 КОЕ/г. В контрольном варианте концентрация Klebsiella pneumoniae составила 10 7 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 6 КОЕ/г. В контрольном варианте концентрация Citrobacter freundii составила 10 7 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 5 КОЕ/г.

Выявлена антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штамма Citrobacter freundii, не выявлена антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штаммов Enterobacter agglomerans и Klebsiella pneumoniae. Препарат «Бактисубтил» определяют как эффективный в отношении штамма Citrobacter freundii и неэффективный в отношении штаммов Enterobacter agglomerans и Klebsiella pneumoniae, выделенных от данного пациента при исследовании на дисбактериоз.

При бактериологическом исследовании кала на дисбактериоз кишечника (№ 461) выявлены Klebsiella pneumoniae в количестве 10 6 КОЕ/г и Citrobacter freundii в количестве 10 6 КОЕ/г.

1 мл суспензии чистой культуры каждого из выделенных штаммов условно-патогенных микроорганизмов в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 9 клеток по оптическому стандарту мутности смешивали с 1 мл суспензии чистой культуры Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893), выделенного из эубиотика «Бактисубтил», в такой же концентрации. Таким образом получили 2 смеси штаммов условно-патогенных микроорганизмов и бацилл. Смеси инкубировали 48 ч при 37°С. Затем проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/ мл для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста всех выделенных культур. Количество выросших микроорганизмов подсчитывали по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости.

В контрольном варианте концентрация Klebsiella pneumoniae составила 10 7 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 5 КОЕ/г. В контрольном варианте концентрация Citrobacter freundii составила 10 8 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 7 КОЕ/г.

Выявлена антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штамма Klebsiella pneumoniae и не выявлена антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штамма Citrobacter freundii. Препарат «Бактисубтил» определяют как эффективный в отношении штамма Klebsiella pneumoniae и неэффективный в отношении штамма Citrobacter freundii, выделенных от данного пациента при исследовании на дисбактериоз.

С использованием разработанной среды с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл изучали антагонизм штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) Да и 96 культур УПМ, выделенных в значимом количестве при исследовании на дисбактериоз кишечника: Citrobacter spp. (16 штаммов), Klebsiella spp. (17), S. aureus (18), Enterobacter spp. (15), типичная E. coli (15), E. coli с атипичными свойствами (15). Антагонистическую активность эубиотика оценивали по числу подавляемых им штаммов тестируемых микроорганизмов (в %) (Табл. 3 - Антагонизм штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) и условно-патогенных микроорганизмов).

Исследования показали, что изучаемый штамм Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) подавляет 17,7% (17 изолятов) испытуемых штаммов УПМ.

Однако снижение количества условно-патогенных микроорганизмов было незначительным - на 0,5-2 lg. Устойчивыми и даже способными к размножению в присутствии эубиотика оказались 79,0% (81 изолят) испытуемых штаммов.

Заявляемый способ позволяет подавлять эубиотический штамм Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893) без ущерба для всхожести тест-культур, что, в свою очередь, обеспечивает выявление антагонистической активности эубиотического штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного при диагностике дисбактериоза кишечника у пациента, что может быть использовано при индивидуальной оценке эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Таблица 1
Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости
А	I	II	III	К-во в 1 мл
1-6	-	-		<1000
8-20	-	-	-	3000
20-30	-	-	-	5000
30-60	-	-	-	10000
70-80	-	-	-	50000
100-150	5-10	-	-	100000
не сосч.	20-30	-	-	500000
-"-	40-60	-	-	1 млн.
-"-	100-150	10-20	-	5 млн.
-"-	не сосч.	30-40	-	10 млн.
-"-	-"-	60-80	Единичные колонии	100 млн.

Таблица 2
Подбор антибиотика для подавления штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) и одновременного роста условно-патогенных микроорганизмов
Рост УПМ при данной концентрации антибиотика, КОЕ/мл	Количество штаммов УПМ, выросших при данной концентрации антибиотика, абс (%)
Стрептомицин, ЕД/мл среды	Пенициллин, ЕД/мл среды
1,0	0,5	0,25	1,0	0,01	0,01	0,001
10 8 (идентично контролю)	1 (4)	8 (32)	10 (40)	16 (64)	19 (76)	22 (88)	23 (92)
10 6	4 (16)	2 (8)	0	4 (16)	3 (12)	3 (12)	2 (8)
10 5	15 (60)	12 (48)	15 (60)	5 (20)	3 (12)	0	0
10 4	3 (12)	3(12)	0	0	0	0	0
<10 4	2 (8)	0	0	0	0	0	0
Рост Bacillus cereus при данной концентрации антибиотика, КОЕ/мл	10 4	10 4	10 4	Отс.	Отс.	Отс.	10 4

Таблица 3
Антагонизм штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) и условно-патогенных микроорганизмов
Тест-культуры УПМ	Кол-во штаммов	Чувствительные штаммы абс (%)	Устойчивые штаммы абс (%)*
Снижение на 1 lg	Снижение на 2 lg	Всего устойчивых штаммов	Из них способны к росту в присутствии эубиотика**
Klebsiella spp	17	1 (5,9)	0	16(94,1)	1 (6.25)
Enterobacter spp	15	4 (26,7)	1 (6,6)	10 (66,7)	1(10)
Citrobacter spp	16	5(31,3)	0	11 (68,7)	1 (9,1)
типичная E. coli	15	1 (6,7)	0	14 (93,3)	0
атипичная E. coli	15	2(13,3)	0	13 (86,7)	1 (7,7)
S. aureus	20	3 (15,0)	0	17 (85,0)	6 (35,3)
* - количество УПМ по сравнению с контролем не изменилось или изменилось не более, чем на 0,5 lg ** - количество УПМ по сравнению с контролем увеличилось

Источники информации

1. Осипова И.Г., Михайлова Р.А., Сорокулова И.Б., Васильева Е.А., Гайдеров А.А. Споровые пробиотики // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 2003. - № 3. - С.113-119.

2. Блинкова Л.П., Семенова С.А., Бутова Л.Г. и др. Антагонистическая активность свежевыделенных штаммов бактерий рода Bacillus // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 1994. - № 5. - С.71-75.

3. Штаммы бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, используемые в качестве компонентов препарата против вирусных и бактериальных инфекций, и препарат на основе этих штаммов. / Патент RU 2142287 , опубл. 10.12.99. - Бюл. N20.

4. Штамм бактерий Bacillus subtilis, обладающий широким спектром антагонистической активности. / Патент RU N2182172, опубл. 10.05.02.

5. Гатауллин А.Г., Михайлова Н.А., Блинкова Л.П., Романенко Э.Е., Елкина С.И., Гайдеров А.А., Калина Н.Г. Свойства выделенных штаммов Bacillus subtilis и их влияние на интестинальную микрофлору экспериментальных мышей // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 2004. - № 2. - С.91-94.

6. Давыдов Д.С., Мефед К.М., Осипова И.Г., Васильева Е.А. Мировое применение споровых пробиотиков в практике здравоохранения // Клиническое питание. - 2007. - № 1-2. - С.А36.

7. Сорокулова И.Б. Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность макрофагов // Антибиотики и химиотерапия. - 1998. - № 2. - С.20-23.

8. Блинкова Л.П. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства, методы выявления // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 2003. - № 3. - С.109-113.

9. Постникова Е.А., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. Поиск перспективных штаммов бифидобактерий и лактобацилл для разработки новых биопрепаратов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2004. - № 2. С.64-69.

10. Gratia A., Fredericq P. Deversite des souches antibiotiques de Escherichia coli et etendue varibile de leur champ d"action. Ibid: 1031-1033.

11. Fredericq P. Actions antibiotiques reciproques chez les Enterobacteriaceae. REV. Belge Pathol. Med. Exp.1948, 19 (Suppl. 4): 1-107.

12. Ермоленко Е.И., Исаков В.А., Ждан-Пушкина С.Х., Тец В.В. Количественная оценка антагонистической активности лактобацилл // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 2004. - № 5. - С.94-98.

13.Ушакова Н.А., Чернуха Б.А. Влияние температурного шока на биологическую эффективность пробиотика Bacillus subtilis 8130 // Клиническое питание. - 2007. - № 1-2. - С.А70.

14. Арзуманян В.Г., Михайлова Н.А., Гайдеров А.А., Баснакьян И.А., Осипова И.Г. Количественный способ оценки отсроченного антагонизма пробиотических культур против оппортунистических дрожжей // Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. - № 5. С.53-54.

15. Способ определения антагонистической активности пробиотиков. / RU Патент № 2187801, опубл. 20.08.2002.

16. Зыкова Н.А., Молокеева Н.В. Новый пробиотический препарат «Трилакт» // Клиническое питание. - 2007. - № 1-2. - С.А42.

17. Методические указания по применению унифицированных микробиологических (бактериологических) методов исследования в клинико-диагностических лабораториях: приложение 1 к приказу Минздрава СССР № 535. - 1986.

18. Sanford Jay P., Gilbert David N., Moeliering Robert C. Jr., Sande Merle A. Twenty-ninth edition The Sanford Guid to antimicrobial therapy, 1999.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ индивидуальной оценки эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника, заключающийся в том, что выделяют условно-патогенные микроорганизмы в чистой культуре из фекалий обследуемого, затем выделяют Bacillus cereus ШТАММ IP 5832 (АТСС 14893) в чистой культуре, после чего осуществляют совместную инкубацию штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) с каждым из штаммов условно-патогенных микроорганизмов в физиологическом растворе с последующим высевом по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл и без него, и при выявлении снижения количества условно-патогенных микроорганизмов на среде с пенициллином по сравнению с количеством условно-патогенных микроорганизмов на среде без пенициллина определяют наличие антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, при этом эубиотик оценивают как эффективный в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.