Реакция преципитации. Механизм
§ 5. Для постановки реакции преципитации необходимо иметь:
а)преципитирующую сыворотку;
б)антиген в виде прозрачного раствора (экстракт из микробных тел, из органов или из других патологических субстратов);
в)физиологический раствор;
г)набор специальных преципитационных пробирок.
Порядок работы
В преципитационную пробирку наливают 0,5 мл преципитирующей сыворотки, затем при помощи пастеровской пипетки наслаивают на сыворотку 0,5 мл раствора антигена. Пробирку при этом следует держать в наклонном положении, а после добавления антигена пробирку ставят в штатив (в вертикальном положении). При положительной реакции на границе двух жидкостей появляется тонкое кольцо помутнения. Степень реакции оценивается по выраженности кольца и времени его появления. Обычно кольцо появляется в течение первых 3-10 минут.
Приготовление бактериального гаптена
Суточная культура бактерий на пластинках МПА в чашках Петри смывается 4-5 мл 1%-ной уксусной кислоты. Смыв кипятят на водяной бане 30-60 минут, фильтруют через асбестовую вату, фильтрат нейтрализуют 20 %-ным раствором углекислого натрия в присутствии индикатора. Полученный гаптен в количестве 0,5 мл наслаивают на равный объем преципитирующей сыворотки, цельной или разведенной вдвое. На границе между сывороткой и гаптеном появляется кольцо преципитата.
§ 6.Реакция преципитации в агаре.
Реакция преципитации в агаре является одним из наиболее чувствительных методов анализа растворимых антигенов. Она позволяет выявить число индивидуальных антигенов в исследуемой жидкости (например, в бактериальных или тканевых экстрактах) и произвести анализ антигенного родства отдельных компонентов в смеси антигенов. Вариант реакции преципитации в агаре для выявления дифтерийного токсина описан в методических указаниях к 7-му занятию.
Для постановки реакции используют I %-ный агар, приготовленный на физиологическом растворе. Тщательно профильтрованный полностью прозрачный расплавленный агар разливают в чашки Петри слоем 0,5 см толщиной. После застывания в пластинке агара с помощью металлической трубочки вырезаются луночки диаметром 5-6 мм - одна в центре чашки и 4-5 по окружности на расстоянии 2 см от центральной. В центральную луночку наливается сыворотка кролика, иммунизированного исследуемым антигеном, а в периферические - раствор исследуемого антигена и сравниваемых с ним веществ. Чашки помещаются в эксикатор с налитой на дно водой (для предупреждения высыхания) при комнатной температуре. Учет результатов реакции производится через 24, 48 и 72 часа.
Антитела из центральной луночки и антигены из периферических диффундируют, навстречу друг другу, и в участках, где создаются эквивалентные концентрации антител и антигенов, выпадает дугообразная полоса преципитации. Появление нескольких полос преципитации между центральной и периферическими луночками указывает на наличие нескольких антигенных компонентов в исследуемой жидкости. Если полосы преципитации, идущие от двух соседних луночек, сливаются, это указывает на идентичность антигенов, содержащихся в этих луночках. Взаимное пересечение полос преципитации свидетельствует о серологической неидентичности антигенов.
Результаты реакции агглютинации
Вывод____________________________________________________________________________________________________________________________________________
Рис.1 Реакция кольцепреципитации (1-опыт; 2-контроль)
Рис.2 Реакция преципитации в агаре
§ 7. В основе методов иммуносорбентного анализа твердой фазы лежит сорбция антител (для обнаружения неизвестного антигена) или антигена (для обнаружения соответствующих антител) и специфических антител, меченных ферментом (ИФМ) или изотопом (РИМ). Чувствительность этих методов значительно превышает чувствительность обычных иммунологических реакций, поэтому они приобрели самое широкое распространение. Практически эти методы могут быть использованы для диагностики любого инфекционного заболевания. С помощью этих методов можно определять как антигены, так и антитела к ним. Методика постановки этих реакций включает три последовательных этапа.
Обнаружение антигена с помощью ИФМ и РИМ.
Первый этап - адсорбция специфических антител твердой фазой, в качестве которой обычно используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых микротитраторных панелей. Антитела нековалентно связываются со стенками лунок, но у них сохраняются свободными активные центры, и они способны поэтому специфически реагировать с соответствующим антигеном.
Второй этап - связывание антигена из суспензии исследуемого материала за счет реакции антитело-антиген, происходящей на границе твердая фаза - жидкость. После этого луночки промывают раствором, содержащим слабый неионный детергент, для удаления из системы других, неспецифически связанных с антителами компонентов.
Третий этап - обработка твердой фазы с фиксированными на ней комплексами антитело - антиген специфическими антителами против данного антигена, но меченными либо ферментом, либо изотопом. Такие меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется из системы промыванием. Таким образом, в случае присутствия в исследуемом материале искомого антигена на поверхности твердой фазы формируется комплекс: антитело-антиген - меченое антитело. Результаты реакции учитывают в зависимости от характера метки. Для иммуноферментного метода антитела метят ферментом, чаще всего пероксидазой или щелочной фосфатазой. Субстратом для пероксидазы служит ортофенилендиамин (ОФД) в смеси с Н 2 0 2 , используемый в виде раствора в цитратно-фосфатном буфере (рН 5,0). Добавление в опытную луночку раствора ОФД приводит к тому, что он подвергается действию персокидазы, фиксированной на антителах, образующиеся продукты реакции имеют желтую окраску, интенсивность которой позволяет количественно оценивать результаты опыта фотометрированием.
Радиоиммуный метод (РИМ) предусматривает использование антител, меченных изотопом, поэтому результаты реакции оценивают путем определения радиоактивности исследуемых образцов. При положительной реакции уровень радиоактивности опытных образцов более чем в 2 раза превышает уровень радиоактивности контрольных, заведомо отрицательных образцов.
Обнаружение специфических антител с помощью ИФМ и РИМ
Для обнаружения антител эти реакции также ставятся в три этапа.
Первый этап - адсорбция специфических антигенов на стенках луночек. Обычно планшеты в коммерческих тест-системах уже имеют сенсибилизированные луночки, т.е. на их стенках антигены уже адсорбированы.
Второй этап - добавление в луночки образцов исследуемой сыворотки для обнаружения в них специфических антител к данному антигену. Если они имеются, то вступают во взаимодействие с антигеном и образуют комплекс антиген-антитело.
Третий этап - после отмывания луночек в них добавляют специфические антиглобулиновые антитела (антивидовые, т.е. антитела против человеческих иммуноглобулинов, но меченные ферментом (ИФМ) либо изотопом (РИМ). Результаты реакции оцениваются как указано выше. В качестве контролей используют образцы, заведомо положительные и заведомо отрицательные.
Рис.3 Схема использования иммуноферментного и радиоиммунного метода для обнаружения антигенов (А) и антител (Б). Обозначения: 1.Поверхность твердой фазы; 2.Специфические антитела; 3.Антиген (исследуемый материал); 4.Специфические к данному антигену антитела, меченные Ферментом (5) или изотопом (6); 7.Субстрат фермента; 8.Специфический антиген; 9.Исследуемая сыворотка (антитела); 10.Антивидовая сыворотка, содержащая антитела к человеческому иммуноглобулину и меченная ферментом (11) или изотопом (12); 13.Субстрат для фермента.
§ 8. Моноклональные антитела - антитела, продуцируемые одним клоном антителообразующих клеток. По всем параметрам антитела, вырабатываемые одним клоном, идентичны (по классу иммуноглобулинов; по их типу и антительной специфичности). Они взаимодействуют только с одним антигеном, и это обстоятельство значительно повышает специфичность всех иммунологических реакций, в которых они участвуют. Получение моноклональных антител стало возможным после того, как в 1975 году Кёллером и Мильштейном была разработана методика получения клеточных гибридов -гибридом путем слияния нормальных лимфоцитов иммунизированных животных с культивируемыми в питательной среде клетками миеломных штаммов. Были использованы такие штаммы, которые не содержали фермента гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы (поэтому они погибают в селективной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин - ГАТ).
Лимфоциты в такой среде не гибнут. Слияние лимфоцитов с миеломными клетками осуществляется с помощью полиэтиленгликоля. Слившиеся гибридомные клетки получают от лимфоцита способность синтезировать определенные антитела (моноклональные антитела, т.е. антитела одной специфичности) и способность выживания в среде с ГАТ. От миеломного партнера они получают способность размножаться бесконечно in vitro.
Накопившийся гибридомный клон может быть размножен, а синтезируемые им моноклональные антитела могут быть получены в неограниченном количестве.
Уже созданы фирмы по выработке моноклональных антител любой специфичности в качестве уникальных реагентов, диагностических и лечебных препаратов.
Получение лимфоцитарных гибридом включает в себя несколько этапов:
1.Получение миеломкой линии.
2.Получение селезеночных клеток от иммунизированного организма.
3.Создание в культуре условий для того, чтобы хотя бы некоторые клетки одной и другой популяции могли осуществить слияние.
4.Выделение слившихся клеток и накопление их клонов.
5.Отбор заданного клона, его накопление и использование. Накопление клона осуществляется in vitro или путем введения животным.
При этом на всех этапах образующиеся клетки необходимо консервировать в жидком азоте, чтобы в любое время можно было вернуться к любому этапу и сохранить на будущее нужные клоны.
В качестве миеломных клеток чаще всего используются мышиные или крысиные клеточные линии. Гибридомы создают не только на основе В - лимфоцитов, обеспечивающих возникновение культур, синтезирующих моноклональные антитела, но и на основе Т - лимфоцитов. Уже сконструированы культуры Т - гибридом, синтезирующие лимфокины.
Контрольные вопросы
По каким признакам определяется степень агглютинации в пробирках?
Как производится оценка степени агглютинации?
Для чего необходим контроль в реакции агглютинации?
При какой степени агглютинации реакция считается еще положительной?
Какая агглютинация происходит раньше: 0- или Н-?
Как отличить осадок бактерий от их агглютинации?
В каких случаях происходит спонтанная агглютинация бактерий?
Что такое групповая агглютинация?
Что такое гаптен? Детерминантная группа? Шлеппер?
Какие компоненты участвуют в реакции преципитации?
Какова методика постановки реакции кольцепреципитации?
Для каких целей используется реакция преципитации в агаре?
Какова методика постановки реакции преципитации в агаре?
В чем заключается сущность реакции пассивной гемагглютинации?
Какие компоненты участвуют в реакции коагглютинации и как она ставится?
В чем заключается сущность реакции латекс-агглютинации?
Как ставится реакция агрегат-гемагглютинации и с какой целью она применяется?
На чем основаны методы иммуносорбентного анализа твердой фазы?
С какой целью используются иммуноферментные методы?
Каким образом с помощью ИФМ можно обнаружить антитела в исследуемой сыворотке?
Каким образом с помощью ИФМ можно обнаружить антиген в исследуемом материале?
Рис.4 Схема реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) Эр-эритроцит; Аг-антиген; Ат-антитела к антигену; Эрс-сенсибилизированный эритроцит.
Как ставится реакция латекс-агглютинации и как она оценивается?
Что такое моноклональные антитела и каковы их преимущества перед обычными иммунными сыворотками?
Как получают моноклональные антитела?
Из каких основных этапов складывается постановка реакций иммуноферментного метода и радиоиммунного метода?
Что такое гибридомы и как их получают? Какие клетки скрещиваются для получения гибридом?
Какая разница между антигенным и антительным эритроцитарным диагноетикумом?
ЗАНЯТИЕ 12
Дата_________________
Тема: ИММУНИТЕТ. РЕАКЦИИ ИММУННОЙ СЫВОРОТКИ
План занятия
1.Регистрация результатов реакции агглютинации, поставленной на предыдущем занятии.
2.Реакция лизиса. Гемагглютинация, гемолиз.
3.Реакция связывания комплекса (РСК). Методика постановки РСК. Постановка основного опыта.
4.Реакция фагоцитоза. Определение фагоцитарного числа. Опсонофагоцитарная реакция (ОФР). Определение завершенности фагоцитоза.
5.Иммунофлуоресцентный метод. Получение диагностических люминесцирующих сывороток и их применение:
а)прямой иммунофлуоресцентный метод;
б)непрямой иммунофлуоресцентный метод.
Приготовление препаратов для люминесцентной микроскопии и обработка их люминесцирующей сывороткой.
6.Знакомство с иммунопрепаратами, применяемыми для профилактики, лечения и диагностики инфекционных заболеваний (сыворотки, гамма-глобулины, вакцины, анатоксины, токсины, аллергены).
Методические указания
§ I. Учесть результаты реакции, поставленной на предыдущем занятии. Обратить внимание на характер агглютинации. Осадок в пробирках в виде плотного с подвернутыми краями слоя, напоминающего перевернутый зонтик. При встряхивании жидкости образуется мелкая зерниcтость. Результаты реакции зарегистрировать в таблице, приведенной ниже.
Реакция преципитации основана на образовании преципитата - осаждении иммунных комплексов антиген-антитело. В растворах они выпадают в осадок, а в гелях откладываются в виде полос. Для определения концентрации антител в исследуемом материале используют очищенные антигены, при этом существует несколько способов проведения реакции преципитации.
Преципитация в растворе
Реакция преципитации в растворах имеет особенность: количество преципитата зависит от количества реагента (антител). Если количество антител меньше количества антигена, то увеличение количества последних приводит к большему образованию преципитата. Наибольшее количество преципитата образуется при относительно равном количестве антигенов и антител. Если антиген находится в избыточном количестве по сравнению с антителами, то при увеличении его концентрации количество преципитата уменьшается.Иммунодиффузия
Наиболее распространенный способ проведения реакций преципитации связан с иммунодиффузией - способностью антител и антигенов проникать в гель.Для простой радиальной иммунодиффузии используют гель, в состав которого включены антитела. В тонком слое геля делают круглые прорези и помещают в них исследуемый материал с антигенами, которые проникают вглубь геля, взаимодействуют с антителами и образуют вокруг лунок кольца преципитата. Таким способом определяют содержание иммуноглобулинов в крови.
Многие реагенты для биохимических анализов выпускают зафиксированными на планшетках. В каждой ячейке планшетки содержится строго отмеренное количество реагента, поэтому можно проводить сразу множество анализов с высокой точностью результатов.
При двойной радиальной иммунодиффузии в тонком слое геля на определенном расстоянии друг от друга вырезают два круглых отверстия. В одно помещают реагент, а в другое - исследуемый материал. Антитела и антигены проникают в гель навстречу друг другу. В месте их взаимодействия образуется преципитат.
Для определения концентрации антигена в исследуемом материале измеряют расстояние от лунки с ним до линии преципитата.
Постановка реакции преципитации в геле.
Особенность этой реакции в том, что взаимодействие антигена с антителом происходит в полутвёрдой среде - геле, чаще агаровом, иногда используют крахмальный гель, полиакриламидный и т. п.
Реакцию преципитации в геле ставят в чашках Петри или на предметных стёклах. Ингредиенты реакции - антиген и антитела - помещают в лунки (колодцы), которые вырезают в агаре.
Различают два метода постановки диффузионной преципитации в агаре: метод простой (или радиальной) иммунодиффузии, когда одно из реагирующих веществ из лунки диффундирует в агар, содержащий постоянную концентрацию другого реагирующего компонента, и метод двойной иммунодиффузии, когда и антиген, и антитело, помещённые в лунки, диффундируют навстречу друг другу в слое агарового геля. На месте встречи антигена и антитела образуются зоны преципитации (кольцо из преципитата при простой иммунодиффузии и линии из преципитата - при двойной иммунодиффузии). В зависимости от сложности системы антиген - антитело может появляться одна или несколько линий преципитации. Чтобы установить титр преципитирующей сыворотки ставят реакции преципитации с различными разведениями антигена. То максимальное разведение антигена, дающее преципитацию с сывороткой, и является титром данной преципитирующей сыворотки.
Примером реакции преципитации в геле может служить реакция между дифтерийным токсином и противодифтерийной сывороткой, которая носит название реакции двойной иммунодиффузии по Оухтерлони.
Токсигенные культуры дифтерийных палочек, посеянные бляшками.
Нетоксигенные культуры, посеянные бляшками.
Фильтровальная бумага, пропитанная противодифтерийной сывороткой.
Линии из преципитата.
Агаровый гель.
Иммуноэлектрофорез сочетает метод электрофореза и реакции преципитации. Смесь антигенов разделяется в геле с помощью электрофореза, затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносится иммунная сыворотка, антитела которой диффундируют в гель и образуют в месте встречи с антигеном линии из преципитата.
С его помощью успешно анализируются белки сыворотки крови, цереброспинальной жидкости, мочи, молока, экстрактов из органов, а также белки растительного и бактериального происхождения.
Реакции лизиса.
Для этого надо знать:
Иммунный лизис - это растворение клеток под при обязательном участии воздействием антител комплемента.
Для реакции необходимы:
1. Антиген - микробы, эритроциты или другие клетки.
2. Антитело - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного.
Иммунную сыворотку получают гипериммунизацией кролика соответствующим корпускулярным антигеном (микробные клетки, эритроциты и др.). Например, в реакции гемолиза и реакции связывания комплемента (см. ниже) используется гемолитическая сыворотка, которую получают гипериммунизацией кролика эритроцитами барана; полученная таким образом сыворотка крови кролика содержит антитела (гемолизины) к эритроцитам барана. Таким образом получают и бактериолитические сыворотки, содержащие антитела, участвующие в лизисе бактерий.
3. Комплемент - термолабильный сложный комплекс белков сыворотки крови, при активации реагирующих между собой в определённой последовательности и образующих мембраноатакующий литический комплекс. В сыворотке комплемент находится в неактивном состоянии и активируется в момент образования комплекса антиген - антитело (адсорбируется на комплексе антиген - антитело). Комплемента много в свежей сыворотке морских свинок.
Из реакции лизиса чаще других применяется реакция гемолиза и реже бактериолиза (главным образом, для дифференциации холерных и холероподобных вибрионов).
Постановка реакции гемолиза .
Для постановки реакции гемолиза необходимы:
3 % взвесь эритроцитов барана на изотоническом растворе;
Стандартная гемолитическая сыворотка, приготовленная в производственных условиях и разведённая изотоническим раствором в 2 - 3 раза меньше, чем её титр (титр гемолитической сыворотки - то наибольшее разведение её, при котором происходит полный гемолиз 3 % взвеси эритроцитов барана в присутствии комплемента);
Комплемент, разведённый изотоническим раствором 1:10.
Если в пробирку поместить в определенных количественных соотношениях эритроциты барана (антиген), гемолитическую сыворотку (антитело) и комплемент, то в течение нескольких минут произойдет изменение смеси: из темно-красной она становится розовой (лаковой) вследствие разрушения эритроцитов и выхода гемоглобина.
Реакция гемолиза обладает строго выраженной специфичностью. Ее используют в качестве индикатора для постановки реакции связывания комплемента.
Преципитации реакция преципитации реакция
реакция взаимодействия in vitro антигена с антителом, приводящая к видимому невооруженным глазом помутнению среды или образованию осадка иммунного комплекса (преципитата). Применяется для идентификации антигенов и антител, контроля чистоты антигена, количественного определения антигенов и антител в исследуемом материале. Дляпостановки П. р. необходимы прозрачные растворы антигена и соответствующей сыворотки.
(Источник: «Микробиология: словарь терминов», Фирсов Н.Н., М: Дрофа, 2006 г.)
Преципитации реакцияпробирочная реакция взаимодействия Ат с Аг в жидкой фазе или в геле, к-рая приводит к образованию видимых невооруженным глазом иммунных преципитатов (помутнения). Применяют для идентификации Аг и Ат, контроля чистоты Аг, количественного содержания Ат и Аг. Для постановки П. р. необходимы прозрачный р-р Аг, антисыворотка, физраствор или гель (1,5 - 2% агаровый и агарозный в вероналацетатном буфере, рН 6,8, ионная сила - 0,1). Чаще используют следующие методики: 1) реакцию колъцепреципитации. В преципитационную пробирку (пробирки) наливают по 0,2 мл преципитирующей с-ки с высоким титром и на нее осторожно наслаивают примерно такое же количество р-ра Аг (цельного или разведенного). В положительном случае через несколько минут на границе реагентов образуется подвижное кольцо белого цвета. Обязательны контроли Аг, с-ки, заведомо положительный, заведомо отрицательный и др. Применяют для идентификации Аг в экстрактах из различных материалов, в т.ч. инфекц.; 2) двойную радиальную иммунодиффузию по Оухтерлони. В равномерном слое 1% агарового геля толщиной около 1,5 мм пробивают лунки на расстоянии 4-10 мм и заполняют их р-рами антисыворотки и Аг. Результат учитывают через сутки (до 6 - 7 сут) инкубации при 4°, 20° и 37°С на влажном или высушенном и окрашенном препарате по числу и расположению линий преципитации. У однокомпонентных систем между лунками с Аг и Ат появляется одна линия, у многокомпонентных -несколько линий, при идентичных Аг линии сливаются, при неидентичных- пересекаются. Используют для качественного анализа, определения чистоты препаратов, идентификации Ат и Аг; 3) простую линейную иммунодиффузию по Удену. Применяют с теми же целями, что и двойную. Содержащий антисыворотку гель разливают по пробиркам или трубочкам. На гель в пробирках наливают р-р Аг, а трубочки помещают в стаканчик с р-ром Аг. Результаты учитывают после выдерживания системы при +4°С в течение 48 ч по наличию преципитата и фронта, к-рый прошел Аг. По формуле находят количество Аг; 4) простую радиальную иммунодиффузию по Манчини. Гель с моноспецифической с-кой ровным слоем наливают на стеклянную поверхность. После застывания в геле пробивают лунки и заливают в них р-ры иссл. Аг. Систему выдерживают 40 ч при +4° или 20°С. В положительных случаях вокруг лунки образуется преципитат, площадь к-рого отражает количество Аг. Аналогичным образом ставят контроль с серией разведении стандартного Аг. Измеряют диаметр зоны преципитата, высчитывают площадь и по калибровочной кривой находят количество Аг в 1 мл субстрата.
(Источник: «Словарь терминов микробиологии»)
Смотреть что такое "преципитации реакция" в других словарях:
реакция преципитации - — [Англо русский глоссарий основных терминов по вакцинологии и иммунизации. Всемирная организация здравоохранения, 2009 г.] Тематики вакцинология, иммунизация EN precipitation reaction … Справочник технического переводчика
- (RW или ЭДС Экспресс Диагностика Сифилиса) устаревший метод диагностики сифилиса. В настоящее время заменён микрореакцией преципитации (антикардиолипиновый тест, MP, RPR Rapid Plasma Reagin). Названа по имени немецкого иммунолога Августа… … Википедия
реакция преципитации - rus реакция (ж) преципитации eng precipitin test, precipitation test fra réaction (f) de précipitation (f) deu Präzipitintest (m), Präzipitations Reaktion (f) spa reacción (f) de precipitación, reacción (f) de precipitinas, prueba (f) de… … Безопасность и гигиена труда. Перевод на английский, французский, немецкий, испанский языки
Метод обнаружения и идентификации антител или растворимых антигенов, основанный на феномене преципитации … Большой медицинский словарь
Преципитация (лат. praecipitatio стремительное падение) В химии и биохимии синоним слова осаждение В иммунологии иммунологическая реакция осаждения из раствора нерастворимого комплекса антиген антитело, образующегося в результате соединения… … Википедия
Метод обнаружения малых концентраций антител, моновалентных гаптенов или поливалентных антигенов, основанный на торможении в их присутствии реакций преципитации, агглютинации или связывания комплемента вследствие специфического блокирования… … Большой медицинский словарь
Модификация реакции преципитации, при которой регистрируют формирование преципитата в виде кольца на границе между растворами антигена и антител … Большой медицинский словарь
Тест на наличие сифилиса, в котором определение характерных для этого заболевания антител в крови обследуемого производится с помощью реакции преципитации. Данный тест является менее доступным, чем некоторые другие.
Заключающаяся во взаимодействии растворимого антигена с антителом с последующим выпадением мелкозернистого осадка (преципитата).
Реакция преципитации позволяет определить в исследуемом материале присутствие неизвестного антигена путем добавления известного антитела или при помощи известного антигена - неизвестное антитело. Преципитация идет хуже в отсутствие солей. Оптимум преципитации находится в диапазоне рН=7,0-7,4.
Механизм преципитации близок к механизму агглютинации. Под влиянием иммунной , прореагировавшей с антигеном, уменьшается степень его дисперсности. Необходимо, чтобы сыворотка и антиген были совершенно прозрачны. При постановке преципитации можно к одному разведению сыворотки добавлять разные разведения антигена либо наоборот.
Преципитация регистрируется лучше, если антиген наслаивать в пробирке на антитело. При этом наблюдается появление преципитата в виде кольца - кольцепреципитация. Кольцепреципитацию проводят в специальных пробирках диаметром 2,5-3,5 мм. Для определения числа антигенов в исследуемом материале или разных антител в сыворотке пользуются реакцией преципитации в агаре: 1% осветленный агар разливают в или на предметные стекла. В разные лунки, сделанные в агаре, наливают растворы антигена и антитела, которые диффундируют навстречу друг другу, образуя линии преципитации. Реакция преципитации широко используется при диагностике (см. Асколи реакция).
Преципитация в агаре позволяет определять токсигенность дифтерийных культур.
В судебно-медицинских исследованиях преципитация служит для установления видовой принадлежности крови, органов и тканей с помощью специфических преципитирующих сывороток.
Преципитация - реакция осаждения комплекса антигена (преципитиногена) и антитела (преципитина). Преципитация - один из иммунологических феноменов, позволяющих определить содержание антител (см.) в сыворотке крови больных или вакцинированных людей, а также в крови иммунизированных животных. При использовании стандартных сывороток реакция преципитации может быть применена для титрования различных по происхождению растворимых антигенов (см.).
При наиболее простой форме постановки реакции преципитации к ряду пробирок с постоянным количеством антигена добавляют подслаиванием исследуемую сыворотку в серии кратных разведений. После 30-60 мин. инкубации при комнатной температуре на границе двух жидкостей образуется кольцо помутнения - кольцепреципитация. Минимальное количество сыворотки, которое дает реакцию преципитации, принимают за титр антисыворотки. При обратной постановке реакции со стандартной антисывороткой удается оценить относительную концентрацию антигена в различных биологических жидкостях.
Результаты титрования антител и антигенов на основании вышеуказанного метода не имеют абсолютного количественного выражения. С целью количественной оценки содержания антител Гейдельбергер, Кабат (М. Heidelberger, Е. Kabat) и др. разработали количественный метод реакции преципитации, в основе которого лежит обнаружение так называемые зоны эквивалентности. При смешивании возрастных количеств антигена с постоянными объемами антисыворотки количество образующегося преципитата первоначально возрастает, а затем вновь снижается из-за увеличения растворимости комплекса антиген - антитело в избытке антигена. Если определить во всех пробирках содержание антител в надосадочной жидкости, то окажется, что в средних пробирках ряда или даже в единственной пробирке антител в надосадочной жидкости нет; вместе с тем здесь же образуется наибольший по величине преципитат. Поскольку в зоне эквивалентности в преципитат вовлекается также весь антиген, введенный в смесь реагирующих веществ, после вычитания из количества белка преципитата белка антигена получают точную величину содержания антител в данном объеме испытуемой сыворотки. Содержание белка преципитата после тщательного промывания охлажденным физиологическим раствором определяют по азоту или каким-либо колориметрическим методом.
При оценке значения реакции преципитации как диагностического метода необходимо учитывать, что в иммунных сыворотках могут присутствовать антитела, не обладающие свойствами преципитинов и, следовательно, не образующие преципитата при взаимодействии с антигеном. К их числу относятся прежде всего неполные антитела, а также некоторые другие антитела, относящиеся к группе гамма-А-глобулинов.
Способность антисыворотки преципитировать антиген может быть нарушена нагреванием до 65-70°, обработкой органическими растворителями, восстановлением в кислой среде [Изликер (Н. Isliker), А.Я. Кульберг]. Феномен преципитации с антисывороткой, заведомо содержащей преципитины, возможен лишь при определенной температуре, концентрации солей и водородных ионов. Быстрее всего реакция преципитации протекает при 25-37°. Непременное условие образования преципитата - присутствие в изотонических концентрациях хлорида натрия (0,85% раствора NaCl). При увеличении концентрации NaCl до 15% преципитаты, образованные антигеном полисахаридной природы, частично растворяются, чем можно воспользоваться для извлечения чистых антител. Реакция преципитации с антигенами белковой природы протекает с одинаковой скоростью и полнотой как в 0,85%, так и в 15% растворах NaCl. Оптимальная для образования преципитата концентрация водородных ионов соответствует значениям рН от 5,0 до 9,0.
В лабораторной практике находят применение различные модификации реакции преципитации. В частности, реакцию термопреципитации применяют для обнаружения антигенов бактерий сибирской язвы, ботулизма и др., не подвергающихся термической денатурации (коктоантигены). Эта реакция отличается от реакции кольцепреципитации только тем, что в качестве антигена используют фильтрат прокипяченного исследуемого материала (см. А сколи реакция).
При анализе с помощью реакции преципитации сложной смеси антигенов невозможно охарактеризовать свойства отдельных компонентов смеси. Для решения этой задачи прибегают к методам преципитации в агаре и к иммуноэлектрофорезу. Метод преципитации в агаре в наиболее распространенной модификации Оухтерлоню (О. Ouchterlony) основал на том, что антиген и антисыворотка, диффундируя навстречу друг другу в тонком слое агара, образуют при встрече линии преципитации. По числу таких линий можно судить о количестве компонентов, содержащихся в данной смеси антигенов. Метод Оухгерлоню позволяет сравнивать различные антигенные смеси и определять степень родства присутствующих в них компонентов. При анализе сложной антигенной смеси, содержащей вещества с одинаковыми скоростями диффузии в агаре, большую помощь может принести метод иммуноэлектрофореза. Смесь антигенов предварительно разделяют в электрическом поле в пластинке агара, после чего проявляют отдельные компоненты антисывороткой. Антисыворотку вносят в ровик, проделанный в агаре параллельно линии, вдоль которой перемещались при электрофорезе антигены. Каждый из антигенов дает с антисывороткой индивидуальную дугу преципитации. Иммуноэлектрофорез широко применяют для анализа патологических отклонений в белках сывороток, а также при иммунологическом анализе тканевых и бактериальных антигенов.
Преципитация в судебно-медицинском отношении . Преципитация применяется в судебной медицине для установления видовой принадлежности крови, частей органов и тканей. В ряде следственных дел требуется установить видовую принадлежность крови, обнаруженной на орудиях совершения преступления, одежде преступника или жертвы и др. Для реакции преципитации применяют преципитирующие сыворотки, получаемые иммунизацией кроликов, петухов, коз белками разных животных. Обычно изготовляют сыворотки, преципитирующие белок человека, лошади, кошки, курицы, свиньи, собаки, рогатого скота. Они должны обладать титром не ниже 1:10 000 и быть достаточно специфичными. Из исследуемого пятна или корочки крови готовят вытяжки на физиологическом растворе, которые затем испытывают преципитирующими сыворотками. Вид белка считается установленным, если одна из преципитирующих сывороток образует преципитат с вытяжкой из исследуемой крови при соответствующей контрольной реакции. Реакцией преципитации можно установить также вид белка тканей и органов человека или животных. Обычно реакцию преципитации производят в пробирках с конусообразным концом. При получении мутных вытяжек реакцию преципитации производят в агаре по Оухтерлоню.